半胱氨酰白三烯受體拮抗劑對氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)皮素1表達(dá)的影響

1、半胱氨酰白三烯受體拮抗劑對氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)皮素1表達(dá)的影響【摘要】目的探討半胱氨酰白三烯(CysLTs)受體拮抗劑(扎魯司特)對白三烯C4(LTC4)刺激人氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)皮素1(ET-1)基因表達(dá)及分泌的影響。方法在離體培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞株(16-HBE)和氣道平滑肌細(xì)胞 (ASMC)培養(yǎng)液中加入扎魯司特，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測培養(yǎng)液ET-1水平；用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測ET-1 mRNA表達(dá)量。結(jié)果扎魯司特可抑制LTC4 誘導(dǎo)16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表達(dá)及ET-1釋放。16-HBE ET-1 mRNA由0.230.10降至0.100.03，E

2、T-1由(12.71.3) ng/L降至(5.52.6) ng/L，前、后比較差異有顯著性(t分別為3.698和4.693，P分別為0.034和0.019)；ASMC ET-1 mRNA由 0.130.04 降至0.040.02；ET-1由(7.51.0) ng/L降至(4.40.9) ng/L，前、后比較差異有顯著性(t分別為4.629和5.003，P分別為0.019和0.007)。結(jié)論扎魯司特能抑制LTC4誘導(dǎo)16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表達(dá)及ET-1釋放，這可能是CysLTs受體拮抗劑抗氣道炎癥的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】白三烯受體拮抗劑；氣道上皮細(xì)胞；氣道平滑肌細(xì)胞；內(nèi)皮素 Z

3、afirlukast inhibition of leukotriene C4 induced endothelin-1 expression in human airway structural CellCHEN Aihuan, ZHONG Nanshan.(Guangzhou Institute of Respiratory Disease，Guangzhou 510120, China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of a cysteinyl leukotriene receptor antagonist (zafirluk

4、ast) on endothelin-1(ET-1) expression in human airway epithelial cell line (16-HBE) and airway smooth muscle cells (ASMC) in response to leukotriene C4 (LTC4) stimulation. Methods16-HBE or ASMC was incubated with 10-8 mol/L LTC4 and graded concentrations of zafirlukast. ET-1 level in supernatant was

5、 determined by ELISA and ET-1 mRNA expression was assessed by RT-PCR. Results(1) LTC4 induced ET-1 mRNA expression in 16-HBE and ASMC was significantly inhibited by zafirlukast (10-8 mol/L ) 0.230.10 vs. 0.100.03 (16-HBE), t=3.698, P=0.034; 0.130.04 vs. 0.040.02 ASMC, t=4.629, P=0.019. (2) When grad

6、ed concentrations of zafirlukast (0, 10-12 mol/L, 10-10 mol/L, 10-8 mol/L, 10-6 mol/L ) were added to the LTC4 cultured 16-HBE and ASMC, a significant inhibition of ET-1 production was observed in both groups cultured with 10-8 mol/L or more zafirlukast (12.71.3) ng/L vs (5.52.6) ng/L 16-HBE, t=4.69

7、3, P=0.019；(7.51.0) ng/L vs (4.40.9) ng/L ASMC (t=5.003, P=0.007). (3) There was a significant negative linear correlation between ET-1 levels and zafirlukast concentrations in LTC4-treated 16-HBE and ASMC (16-HBE: r=-0.9177, P=0.0289; ASMC: r=-0.9451, P=0.0153）. ConclusionsThese data suggest that z

8、afirlukast inhibis LTC4- induced ET-1 over-expression 16-HBE and ASMC, which may be one of the anti-inflammatory mechanism of LTs receptor antagonists.【Key word】Leukotriene receptor antagonist；Airway epithelial cell；Airway smooth muscle cell；Endothelin半胱氨酰白三烯( CysLTs)受體拮抗劑是近年來發(fā)展起來的新一代非類固醇類抗哮喘藥。研究證明，

9、CysLTs受體拮抗劑具有抗氣道炎癥作用1，但有關(guān)其抗氣道炎癥的機(jī)制尚未明了。近年發(fā)現(xiàn)，氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞自分泌的內(nèi)皮素1(ET-1)是氣道收縮、炎癥與重建的重要介質(zhì)2，已知參與哮喘發(fā)病過程的眾多細(xì)胞因子是通過形成相互作用的網(wǎng)絡(luò)而發(fā)揮效應(yīng)的，Patrigani等3報(bào)道CysLTs 能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞釋放ET-1。因此有理由推測CysLTs是否亦能促進(jìn)氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞釋放ET-1，而CysLTs受體拮抗劑可能對抗CysLTs 的此種效應(yīng)，從而產(chǎn)生抗氣道炎癥作用，我們的研究通過觀察 CysLTs受體拮抗劑(扎魯司特)對白三烯C4(LTC4)刺激人氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞 ET-1基因表達(dá)及分泌的影響，探討

10、CysLTs受體拮抗劑抗氣道炎癥的機(jī)制。材料與方法一、材料1.正常人氣道上皮細(xì)胞株(16-HBE)由英國Southampton大學(xué)惠贈(zèng)。2.扎魯司特(zafirlukast)由英國Zeneca公司惠贈(zèng)。3.MEM培養(yǎng)液：含10%胎牛血清，200 U/ml 青霉素，200 U/ml 鏈霉素。4.F12培養(yǎng)液：含10%胎牛血清，200 U/ml 青霉素，200 U/ml鏈霉素。5.平滑肌細(xì)胞消化液：含640 U/ml 膠原酶，1 mg/ml豆胰蛋白酶，10 U/ml彈性蛋白酶， 0.2 mmol/L氯化鈣。二、方法1.LTC4對人氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)及ET-1分泌水平的作用： 取第3

11、5代16-HBE細(xì)胞，以每孔1105 ml接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿85%90% 瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分5組，每組4孔。對照組（ELT 0組）：只加MEM空白培養(yǎng)液及ELT 14組，分別加入10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8moL/l、10-6 mol/L LTC4后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，密封保存于-80 低溫冰箱中待測ET-1。收集 ELT 0組及ELT 3組(預(yù)試驗(yàn)證明該濃度刺激ET-1分泌作用最強(qiáng))細(xì)胞提取總RNA，待進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。 取肺移植供體支氣管肺組織，參照文獻(xiàn)4的方法，用3 ml平滑肌消化液室溫下消化分離氣道

12、平滑肌細(xì)胞(ASMC)，用F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞長至基本融合狀態(tài)后用0.25% 胰蛋白酶消化傳代。取第35代ASMC，以每孔1105 ml接種于6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞長滿85%90% 瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分5組，每組4孔。對照組（SLT 0組）：只加 F12空白培養(yǎng)液及SLT 14組， 各組分別加入10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L LTC4后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液待測ET-1。收集SLT 0組及SLT 3組細(xì)胞提取總RNA，待進(jìn)行RT-PCR。2.扎魯司特對LTC4刺激氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)及ET-1分泌的

13、影響：將16-HBE及ASMC(來源同上)均分為5組(16-HBE：ELZ 04組)，每組4孔，每組加入相同濃度的LTC4 (10-8 mol/L)， 但加入不同濃度扎魯司特，其濃度分別為0、10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L、10-6 mol/L。加LTC4和扎魯司特后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液待進(jìn)行ET-1水平測定。收集扎魯司特濃度為0(SLZ 0組)及10-8 mol/L(SLZ 3組)2孔細(xì)胞提取總RNA，待進(jìn)行RT-PCR。3.ET-1水平測定：用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定ET-1(美國R&D公司)水平。4.RT-PCR測定ET-1基因表

14、達(dá)水平4：采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA。采用美國Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后通過PCR擴(kuò)增ET-1 cDNA和-actin cDNA。ET-1引物序列：上游：5AACCATGGATTATTTGTCCATG3，下游：5AGTGTTGACCCAAATGATGTC3，此對引物擴(kuò)增出一條230 bp的ET-1 cDNA片段。-actin引物序列：上游：5ATCTGACACCACACCTTCTACAATGAGC TGCG3，下游：5CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCAC ATCTG 3，此對引物可擴(kuò)增出一條838 bp的-actin cDNA片段。PCR反

15、應(yīng)條件為：94 變性1 min， 59 退火1 min，72 延伸 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 加強(qiáng)延伸7 min。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Origin 4.1統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以s表示，組間采用兩個(gè)樣本均數(shù)t檢驗(yàn)來比較。結(jié)果一、LTC4對16-HBE及ASMC ET-1mRNA表達(dá)及ET-1分泌的影響LTC4可刺激16-HBE及ASMC分泌ET-1，當(dāng)LTC4濃度10-8 mol/L時(shí)，兩種細(xì)胞ET-1分泌水平均顯著高于對照組(P均0.05，1)。 LTC4可使兩種細(xì)胞ET-1mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，16-HBE由0.190.15上調(diào)至0.430.2（t=7.160，P=0.005)；ASMC

16、由0.380.14上調(diào)至0.540.14（t=4.833，P=0.017)。二、扎魯司特對LTC4誘導(dǎo)16-HBE及ASMC ET-1 mRNA表達(dá)及ET-1分泌的影響扎魯司特可抑制LTC4誘導(dǎo)16-HBE及ASMC釋放ET-1，當(dāng)扎魯司特濃度10-8 mol/L時(shí)，兩種細(xì)胞ET-1分泌水平明顯低于對照組16-HBE：(12.71.3) ng/L降至(5.52.6) ng/L，t=4.693，P=0.019；ASMC：(7.51.0) ng/L降至(4.40.9) ng/L，t=5.003，P=0.007，表 1。扎魯司特對LTC4誘導(dǎo)16-HBE及ASMC分泌ET-1的劑量-效應(yīng)關(guān)系均呈顯著

17、直線負(fù)相關(guān)(16-HBE：r=-0.9177，P=0.0289；ASMC：r=-0.9451，P=0.0153)。扎魯司特可明顯抑制LTC4誘導(dǎo)16-HBE及ASMC ET-1mRNA表達(dá)，16-HBE ET-1 mRNA由0.230.10降至0.100.03（t=3.698，P=0.034)；ASMC ET-1 mRNA由0.130.04降至0.040.02（t=4.629，P=0.019)。1LTC4對人氣道上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞ET-1分泌水平的影響表1 扎魯司特對LTC4刺激人氣道上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞ET-1分泌水平的影響(s)組別標(biāo)本數(shù)ET-1濃度（ng/L）上皮細(xì)胞平滑肌細(xì)胞LZ0組

18、412.71.37.51.0 LZ1組411.61.66.91.4LZ2組4 11.11.86.81.4LZ3組49.61.6*4.81.7*LZ4組45.52.6*4.40.9*注：LZ04組LTC4 濃度均為10-8 mol/L，而扎魯司特濃度分別為0、10-12、10-10、10-8、10-6 mol/L；與對照組(LZ0)比較*P0.05，*P0.01 討論白三烯（LTs）是花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶（5-LO）代謝途徑形成的代謝產(chǎn)物，包括二羥酸白三烯(LTB4)及半胱氨酰白三烯(包括LTC4 、LTD4 、LTE4)。LTs的主要生物學(xué)活性3包括：（1）引起氣道平滑肌收縮；（2）增加血管

19、通透性；（3）增加粘液分泌；（4）促進(jìn)嗜酸細(xì)胞（EOS）等炎癥細(xì)胞在氣道的聚集5；（5）促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞等增殖，從而參與氣道重塑6，7?？梢奓Ts在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)都起作用。但CysLTs配基與受體作用方式存在種屬差異，如豚鼠的氣道中存在CysLT1和CysLT2受體，LTD4和LTE4作用于CysLT1受體，LTC4作用于CysLT2受體。而人的氣道中僅存在CysLT1受體，LTC4、LTD4和LTE4均作用于CysLT1受體8，9。研究表明，LTC4和LTD4可促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成血小板衍生生長因子及血栓素10，11。 Patrigani等3亦報(bào)道，LTC4 能使血

20、管平滑肌細(xì)胞ET-1釋放增加。本組研究結(jié)果顯示，LTC4能使離體培養(yǎng)的人氣道上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞 ET-1分泌增加，而此種增加與ET-1mRNA的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。目前亦有研究提示，CysLTs受體拮抗劑具有消除氣道炎癥的作用。 Calhoun等1報(bào)道，輕度哮喘患者吸入抗原可使支氣管肺泡灌洗液（BALF）中EOS、淋巴細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，口服扎魯司特 20 mg/d 1周后，再吸入抗原其BALF中上述細(xì)胞計(jì)數(shù)較安慰劑組明顯減少。Kemp等12報(bào)道，扎魯司特可明顯抑制哮喘患者吸入抗原后BALF中TNF-a水平的升高。本組結(jié)果亦顯示，扎魯司特可使 LTC4刺激人氣道上皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞E

21、T-1 mRNA的表達(dá)下調(diào)及ET-1的分泌減少，且其抑制作用與扎魯司特的濃度呈高度直線相關(guān)。如前所述，氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞自分泌的ET-1是氣道收縮、炎癥及重建的重要介質(zhì)，CysLTs受體拮抗劑抑制多種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)特別是ET-1的釋放可能是其抗氣道炎癥的重要機(jī)制。抗白三烯藥物為哮喘的防治提供了又一新的途徑，并逐漸顯示出其臨床價(jià)值，1998年全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)已將其列為中、重度持續(xù)哮喘的預(yù)防用藥，但有關(guān)其在哮喘防治中的確切地位、長期效果及其抗氣道炎癥及重塑的其他機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。作者單位：陳愛歡(510120 廣州呼吸疾病研究所)鐘南山(510120 廣州呼吸疾病研究所)參考文獻(xiàn)1.

22、Calhoun WJ, Lavins BJ, Glass M, et al. Effect of accolate (zafirlukast) on bronchoalveolar lavage fluid (BAL) after segmental antigen bronchoprovocation ( SBP ) in patients with mild to moderate asthma. Am J Respir Crit Care Med, 1995,151:42.2.Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura G, et al. A novel poten

23、t vasoconstriction peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988, 332:411-415.3.Patrigani P, Modica R, Bertolero F, et al. Differential effects of leukotriene C4 on endothelin-1 and prostacyclin release by cultured vascular cells. Pharmacol Res, 1993, 27 : 281.4.文思成,徐軍,鐘南山. 反義寡核苷酸對氣道平

24、滑肌細(xì)胞內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶及內(nèi)皮素1表達(dá)的影響. 中華結(jié)核和呼吸雜志,1999,22：279-282.5.Laitinen L, Laitinen A, Haahtela T, et al. Leukotriene E4 causes granulocyte infiltration into asthmatic airways. Lancet, 1993, 341:989-990.6.Leikauf GD, Claesson HE, Doupnik CA. Cysteinyl leukotrienes enhance growth of human airway epithelial cells.

25、 Am J Physiol, 1989,259:255. 7.Wang CG, Du T, Xu LJ, et al. Role of leukotriene D4 in allergen-induced increases in airway smooth muscle in the rat. Am Rev Respir Dis, 1993,148:413- 417.8.Buckner CK, Fedyna JS, Robertson JL, et al. Examination of the influence of the epithelium on contractile responses to peptidoleukotrienes and blockade by ICI 204,219 in isolated guinea-pig