厭氧培養(yǎng)方法

1、厭氧性細(xì)菌的分離培養(yǎng)法厭氧菌需有較低的氧化還原勢(shì)能才能生長(zhǎng) （ 例如破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌需氧化還原電勢(shì) 降低至 0.11V 時(shí)才開始生長(zhǎng) ） ，在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化還原電勢(shì)較高，不適于厭 氧菌的生長(zhǎng)。 為使培養(yǎng)基降低勢(shì)， 降低培養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十分必要的。 現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚 多，主要有生物學(xué)，化學(xué)和物理學(xué) 3 種方法，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用。1 生物學(xué)方法培養(yǎng)基中含有植物組織 （如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等 ）或動(dòng)物組織 （ 新鮮無菌的小片組 織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等 ） ，由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而消耗 氧氣 （ 如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣

2、，碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用，就是根據(jù)這 個(gè)原理 ） ，組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化還原電勢(shì)下降。另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個(gè)平皿內(nèi)，利用需氧菌的生長(zhǎng)將氧消耗后，使 厭氧菌能生長(zhǎng)。 其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌（如枯草桿菌 ） ，另一半接種厭氧菌， 接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上， 并用石蠟密封， 置 37 恒溫箱中培養(yǎng) 23d 后，即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長(zhǎng)。2 化學(xué)方法利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)， 將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收， 或用還原氧化型物質(zhì)， 降 低氧化還原電勢(shì)。（）李伏夫 （B M JIbbob） 法此法系用連二亞硫酸納 （Sodium h

3、ydrosulphite） 和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣， 其反應(yīng) 式如下：Na2S204 十 Na2C03 十 O2 一 Na2SO4十 Na2SO3十 C02 取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi) （ 如系液體培 養(yǎng)基，則直立于罐內(nèi) ） ，最上端保留可容納 12 個(gè)平皿的空間 （視玻罐的體積而定 ），按玻罐 的體積每 1000cm3 空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各 30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿 中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內(nèi)水分過多。若用無蓋玻罐，則可將平皿 重疊正放在淺底容器上，以無蓋玻罐罩于皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉 （如圖 ） 。

4、（）焦性沒食子酸法 焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣，同時(shí)由淡棕變?yōu)樯钭厣慕剐詻]食橙（Purpurgallin） 。每 l00cm3 空間用焦性沒食子酸 1g 及 10氫氧化納或氫氧化鉀 l0ml ，其 具體方法主要有下列幾種：1 ）單個(gè)培養(yǎng)皿法： 將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊，中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片，在 其上放焦性沒食子酸 0.2g 及 10 NaOH溶液 0.5mL。迅速拿去皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置于其上， 周圍以融化石蠟或膠泥密封。將此玻璃板連同培養(yǎng)皿放人 37C 溫箱培養(yǎng) 2448h 后，取出觀 察。2 ） Buchner 氏試管法：取一大試管， 在管底放焦性沒

5、食子酸 0.5g 及玻璃珠數(shù)個(gè)或放一螺旋狀鉛絲。 將已接種的培 養(yǎng)管放人大試管中，迅速加入 20NaOH溶液 0.5ml ，立即將管口用橡皮塞塞緊，必要時(shí)周 圍封以石蠟， 37 培養(yǎng) 2448h 后觀察 （ 圖 ）。） 玻罐或干燥器法： 置適量焦性沒食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，將培養(yǎng)皿或試管置于隔板上，并在玻 罐內(nèi)置美藍(lán)指示劑一管， 從罐側(cè)加入氫氧化鈉溶液放于罐底， 將焦性沒食子酸用紙或紗布包 好，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，待一切準(zhǔn)備好后將線放下，使焦性沒食子酸落人氫 氧化納溶液中，立即將蓋蓋好；封緊，置溫箱中培養(yǎng)。）瑞 （Wright） 氏法： 將已接種細(xì)菌的培養(yǎng)管的脫脂棉塞在火焰

6、中燒灼滅菌后，塞人管中離培養(yǎng)基11 5cm處，置適量焦性沒食子酸于其上，加入 10 NaOH溶液 2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥 或石蠟嚴(yán)密封閉置溫箱中培養(yǎng) （ 圖 ） 。）史 （Spray） 氏法： 用圖所示的厭氧培養(yǎng)皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸，另一邊置氫氧化鈉溶液，將 已接種的平皿翻蓋于皿上， 并將接合處用膠泥或石蠟密封完全， 然后搖動(dòng)底部， 使氫氧化鈉 溶液與焦性沒食子酸混合，置溫箱中培養(yǎng)。）平皿法： 置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細(xì)菌，下面的平皿盛焦性沒食 子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封固后，置溫箱中培養(yǎng)（圖） 。）硫乙醇酸鈉法硫乙醇酸鈉 （HSCH2CO

7、ONa是） 一種還原劑， 加入培養(yǎng)基中， 能除去其中的氧或還原性物質(zhì)， 促 使厭氧菌生長(zhǎng)。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。A 液體培養(yǎng)基法：將細(xì)菌種人含 0.1 的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中， 37培養(yǎng) 2448h后觀察，本培養(yǎng)基中加 美藍(lán)液作為氧化還原的指示劑，在無氧條件下，美藍(lán)被還原成無色。固體培養(yǎng)基法：常采用特殊構(gòu)造的 Brewer 培養(yǎng)皿， 可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)而形成孤立的菌落； 操作 過程是先將 Brewer 氏皿干熱滅菌， 將溶化且冷卻至 50左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾人 皿內(nèi)。 待瓊脂冷凝后，將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分。 蓋上皿蓋，使皿蓋內(nèi)緣與培養(yǎng)基外圍

8、部分相互緊密接觸（圖 10） 。此時(shí)皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的少量 氧氣可被培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鈉還原，故美藍(lán)應(yīng)逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，故 仍呈藍(lán)色。將 Brewer 氏培養(yǎng)皿置于 37恒溫箱內(nèi)，經(jīng)過 2448h 后觀察。3 物理學(xué)方法 利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭 氧狀態(tài)，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育。（）厭氧罐法常用的厭氧罐有 Brewer 氏罐， Broen 氏罐和 Mclntosh-Fildes 二氏罐（圖 11）。將 接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣， 代以氫氣至大氣壓。 通電，使 罐中殘存的氧與氫經(jīng)鉑或

9、鈀的催化而化合成水， 使罐內(nèi)氧氣全部消失。 將整個(gè)厭氧罐放人孵 育箱培養(yǎng)。本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。（）真空干燥器法 將欲培養(yǎng)的平皿或試管放人真空干燥器中，開動(dòng)抽氣機(jī)，抽至高度真空后，替代以氫、氮 或二氧化碳?xì)怏w。將整個(gè)干燥器放進(jìn)孵育箱培養(yǎng)。（）高層瓊脂法加熱融化高層瓊脂，冷至 45左右接種厭氧菌， 迅速混合均勻。 冷凝后 37培養(yǎng)，厭氧 菌在近管底處生長(zhǎng)。（）加熱密封法 將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏蒸鍋內(nèi)加熱 l0min ，驅(qū)除溶解于液體中的空氣，取出，迅速置 于冷水中冷卻。 接種厭氧菌后， 在培養(yǎng)基液面覆蓋一層約 0.5cm 的無菌凡士林石蠟， 置 37 培養(yǎng)。此外，尚有搖振培養(yǎng)法，此處從略。（）二氧化碳培養(yǎng)法少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌 （ 牛型）等，孵育時(shí)，需大氣中添加5 10二氧化碳，方能使之生長(zhǎng)繁殖旺盛。 常用的方法是置于 CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)； 最簡(jiǎn)單的二氧化碳培養(yǎng)法是在盛 放培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi)， 燃點(diǎn)蠟燭， 當(dāng)火焰熄滅時(shí)， 該缸的大氣中， 就約增加了 5 10 的二氧化碳。 也可用化學(xué)