人的 紅細胞補體受體1(CR1)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒

1、Uscn Life Science Inc. Wuhan網(wǎng)址: 電話: +86 27 84259552傳真: +86 27 84259551E-mail: uscnk人的紅細胞補體受體1(CR1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書產(chǎn)品編號:E1123Hu規(guī)格:96T本試劑盒僅供體外研究使用,不用于臨床診斷!預(yù)期應(yīng)用本酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中CR1含量。本試劑盒已提供的試劑試劑名稱數(shù)量試劑名稱數(shù)量96孔板(預(yù)包被 1 96孔板覆膜 4標準品(凍干 2 標準品稀釋液 1 × 20ml檢測溶液A (綠色 1 × 120l

2、 檢測稀釋液A(2 x 1 × 6ml檢測溶液B (紅色 1 × 120l 檢測稀釋液B(2 x 1 × 6mlTMB底物 1 × 9ml 終止液 1 × 6ml濃洗滌液(30 x 1 × 20ml 使用說明書 1本試劑盒未提供但需自備的設(shè)備及試劑1、450±10nm濾光片的酶標儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱2、單道和多道微量加液器及吸頭3、稀釋樣品的EP管4、蒸餾水或去離子水5、吸水紙6、盛放洗液的容器試劑盒的儲存及有效期所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意,收到試劑盒后請盡快將標準品、檢測溶液A、檢測溶液B以及96孔板保

3、存于-20。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20,避免潮濕。有效期為6個月。 實驗原理將CR1抗體包被于96孔微孔板中,制成固相載體,向微孔中依次加入標準品和標本,其中的CR1與連接于固相載體上的抗體結(jié)合,洗板之后加入生物素化的CR1抗體,將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后,加入HRP標記的親和素,再次徹底洗滌后加入底物(TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CR1呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(值,計算樣品濃度。標本的采集與保存1、血清:將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置30分鐘或4過夜,然后1000g離心2

4、0分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2、血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2 - 81000g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應(yīng)避免 反復(fù)凍融。3、其它生物標本:請1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注意: 1、以上標本均需密封保存,4保存應(yīng)小于1周,-20不應(yīng)超過1個月,-80不應(yīng)超過2個月。2、標本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫,不應(yīng)加熱使之融解。3、標本溶血會影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。試劑準備1、使用前將所有的試劑

5、和標本緩慢均衡至室溫(18-25,試劑不能直接在37溶解。2、標準品(凍干品:每瓶標準品用標準品稀釋液稀釋至1mL,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為2,000 pg/mL(貯液。先將其稀釋為1,000 pg/mL (標準曲線最高濃度后,再準備7個稀釋標準品的EP管,每個EP管中加入500的標準品稀釋液,如圖所示依次倍比稀釋成1,000 pg/mL,500 pg/mL, 250 pg/mL,125 pg/mL,62.5 pg/mL,31.2 pg/mL,15.6 pg/mL,標準品稀釋液(0 pg/mL直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品

6、溶液。 Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9pg/mL 2,000 1,000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 03、標本:血清或血漿標本推薦稀釋大約200-500倍,標本使用0.02 M 的PBS稀釋( PH=7.0-7.2。4、檢測稀釋液A及檢測稀釋液B:用6mL蒸餾水或去離子水將6mL濃檢測液A及B稀釋至12mL,進行2倍稀釋,稀釋后的工作液不宜進行冷凍保存。5、檢測溶液A及檢測溶液B:Detection A 及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A或B1:100稀釋(如:10 檢測溶

7、液A / 990檢測稀釋液A,充分混勻,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(100/孔,實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2mL。6、濃洗滌液:用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL,進行30倍稀釋。7、底物溶液:請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB至另一干凈容器中使用,容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄,不要倒回TMB瓶中。注意: 1、標準品請于臨用前15分鐘內(nèi)配制。該標準品只能使用一次。2、標準品的稀釋不能直接在板中進行。3、標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆?；靹驎r要輕輕充分混勻,避免起泡。為保證實驗結(jié)果的準確請使用微量吸

8、管,并校準微量加液器。請依據(jù)所需的量精確配制,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A 時,一次不要小于10,以避免造成濃度誤差。4、請勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液和檢測溶液B工作液。5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出,請先溫育至室溫,輕輕混勻,至到結(jié)晶完全溶解再進行配制。操作步驟實驗前應(yīng)預(yù)測標本含量,如果標本濃度過高,應(yīng)對標本進行稀釋,使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。1、加樣:分別設(shè)標準孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標準孔7孔,依次加入100 不同 濃度的標準品(見試劑準備2。空白孔加 100 (見試劑準備第二步最后一管,余孔加待測樣品100,酶標板加上覆膜,

9、37溫育2小時。2、棄去液體,甩干,不用洗滌。3、每孔加檢測溶液A工作液 100(臨用前配制,酶標板加上覆膜,37溫育1小時。4、棄去孔內(nèi)液體,每孔用400的洗滌液洗滌,浸泡1-2分鐘,甩干(也可輕拍將孔內(nèi) 液體拍干,重復(fù)洗板3次。最后一次洗滌后,要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。5、每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制100,加上覆膜,37溫育30分鐘。 6、棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟4。7、每孔加底物溶液90,酶標板加上覆膜,37避光顯色(反應(yīng)時間控制在15-25分鐘,不要超過30分鐘。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,后3-4孔梯度不明顯時,即可終止。8、每孔加終止溶液50,終止

10、反應(yīng),此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一,請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。9、在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后,立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(值。注意: 1、試劑準備:準備一次實驗所需要的酶標條,其它的可從微孔板上拆下,密封,按照說明書要求保存,以備下次使用。2、加樣:實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡,將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時,第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。因此,一次

11、加樣時間(包括標準品及所有樣品最好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。3、溫育:為防止樣品蒸發(fā),實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā),洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài),同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。4、洗滌:充分的洗滌非常重要,在每次洗滌過程中,都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響最后的酶標儀讀數(shù)。5、反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘觀察一次,如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強從

12、而影響酶標儀光密度讀數(shù)。6、底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。洗板方法1、手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4mL注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,吸去(不可觸及板壁或甩掉酶標板內(nèi)的液體,在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。2、自動洗板:如果有自動洗板機,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算各標準品及樣本值扣除空白孔值后作圖(七點圖,如設(shè)置復(fù)孔,則應(yīng)取 其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標,值為橫坐標(對數(shù)坐標,在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線(最佳方程式應(yīng)依回歸方程計算的R2值來定,以R2值越趨近于1為好。推薦使用專業(yè)制作曲線軟

13、件進行分析,如curve expert 1.3,根據(jù)樣品值,由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與值計算出標準曲線的回歸方程式,將樣品的值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣 品的實際濃度。檢測范圍:15.6 pg/mL - 1,000 pg/mL最低檢測限:4.1 pg/mL此值為20個空白樣品(即標準品稀釋液測定的平均值加三倍標準差所對應(yīng)的濃度。特異性本試劑盒用于檢測人的CR1,靈敏度高,特異性好,且與其它相關(guān)蛋白無明顯交叉反應(yīng)。典型數(shù)據(jù)為了便于計算,盡管濃度為自變量而O.D.值為因變量,我們繪圖時仍采用標準品的O.D.值作為橫坐標(X軸,標準品的濃度為縱

14、坐標(Y軸。同時為了試驗結(jié)果的直觀性,圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對數(shù)值。推薦使用對數(shù)值建立標準曲線圖。由于實驗操作條件的不同(如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等,標準曲線的O.D.值會有所差異。所提供的標準曲線僅供參考,實驗者需要根據(jù)自已的實驗建立標準曲線。 圖1:人的紅細胞補體受體1(CR1試劑盒標準曲線說明 1、由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析,本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。2、最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),請務(wù)必準備充足的標本備份。3、本試劑盒不能排除標本中可能含有的可溶性受體,配體,結(jié)合蛋白和其它相關(guān)因子對實驗所產(chǎn)生的干擾。4、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果,因為所有試劑都是有關(guān)聯(lián)的,不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。5、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。6、剛開啟的酶聯(lián)板孔