急性移植物抗宿主病病人血清IL-2、IL-8、IL-10及TNF-α水平變化的研究(1)

1、急性移植物抗宿主病病人血清IL-2、IL-8、IL-10及TNF-水平變化的研究(1)                 作者：王書紅，達(dá)萬明，靳海杰，靖域，顏光濤【摘要】  為了探討細(xì)胞因子IL-2、TNF-、IL-10、IL-8在異基因造血干細(xì)胞移植后aGVHD發(fā)病中的作用，觀察33例Allo-HSCT患者aGVHD的發(fā)病情況。aGVHD的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)，部分病例還依據(jù)皮膚、腸粘膜活檢的病理學(xué)變化。移植前后定

2、期采集患者血清，采用放射免疫法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、TNF-、IL-10、IL-8的濃度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異基因造血干細(xì)胞移植后33例患者均獲得造血功能重建，13例發(fā)生aGVHD，其中8例度aGVHD，5例-度aGVHD。IL-2、TNF-水平在aGVHD陽性組明顯高于aGVHD陰性組，而IL-10的水平在aGVHD陽性組明顯低于aGVHD陰性組，IL-8水平的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論： 細(xì)胞因子IL-2、TNF-在臨床aGVHD的發(fā)病中起重要的正向調(diào)節(jié)作用，定期檢測(cè)患者血清的IL-2、TNF-水平有助于預(yù)測(cè)aGVHD的發(fā)生。 【關(guān)鍵詞】  IL-2； TNF-； IL-10； IL-

3、8； 急性移植物抗宿主?。?異基因造血干細(xì)胞移植Changes of  IL-2，IL-8，IL-10 and TNF-  levels in Sera of Patients with  Acute Graft-Versus-Host DiseaseAbstract    The purpose of this study was to explore the roles of cytokines  IL-2，TNF-，IL-10 and IL-8 in the pathogenesis of acute graft-ve

4、rsus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The incidence of aGVHD was observed in 33 patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. The aGVHD was clinically diagnosed. Sera from the 33 patients were taken before and after allogeneic hematopoi

5、etic stem cell transplantation.  The IL-2，TNF-，IL-8，IL-10 levels  in serum of 33 patients were measured serially  by  using radioimmuno-assay(RIA). aGVHD occured in 13 patients  including 8 patients with aGVHD I and 5 patients with aGVHD -.  The results showed that the

6、circulating levels of IL-2  and TNF-  were markedly elevated during aGVHD and strongly correlated with the severity of aGVHD as compared with  patients without aGVHD. However，the level of the IL-10 in patients with aGVHD was significantly  lower than that in patients  withou

7、t aGVHD. The change of IL-8 level was not significant statistically.  It is concluded  that IL-2 and TNF- may play important roles in the pathogenesis of aGVHD，and  measurement of serum IL-2 and TNF- levels after allo-HSCT can provide predictive indicator for acute GVHD.Key words 

8、;  IL-2; TNF-; IL-10;  IL-8;  aGVHD; allo-HSCT異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是治療惡性血液病和非惡性遺傳性缺陷的有效手段，移植后涉及一系列移植相關(guān)并發(fā)癥，如急性、慢性移植物抗宿主病、肝靜脈閉塞綜合癥、嚴(yán)重感染、間質(zhì)性肺炎等。其中，急性移植物抗宿主?。╝GVHD）是異基因造血干細(xì)胞移植的主要并發(fā)癥之一，發(fā)生率高達(dá)30%-60%，并造成約20%的移植相關(guān)死亡率，嚴(yán)重影響患者的生存時(shí)間和生存質(zhì)量。因此，aGVHD的發(fā)病機(jī)理研究是當(dāng)今移植免疫的重點(diǎn)課題。aGVHD發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是供者來源的T細(xì)胞識(shí)別受者的異體抗原而

9、被激活，由于過量釋放細(xì)胞因子引起受者多器官損傷的免疫病理過程。本研究探討可能引發(fā)aGVHD的細(xì)胞因子的作用，以期對(duì)aGVHD更好的早期防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法臨床資料及研究對(duì)象以33例異基因造血干細(xì)胞移植患者作為研究對(duì)象。所有33例病例均來自我院及307醫(yī)院，研究時(shí)間為2002年2月至 2005年 2月，其中男性17例，女性16例，年齡 17-48歲 (中位年齡為31歲 )。33例中慢性粒細(xì)胞白血病 8例（慢性期 6例、加速期2例），急性非淋巴細(xì)胞白血病 15例，（完全緩解12例，M5原發(fā)耐藥未緩解 2例，M6復(fù)發(fā)1例），骨髓增生異常綜合征 4例（RA 3例、RAEB-T 1例），急性淋巴

10、細(xì)胞白血病完全緩解3例，淋巴瘤（NHL/ALL）中樞受累1例，急性再生障礙性貧血1例，左乳低分化腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移1例。供者情況同胞供者30例，非親緣供者2例（臺(tái)灣慈濟(jì)骨髓庫），非親緣臍血1例（山東臍血庫）。HLA配型及ABO血型33例供受者HLA配型的結(jié)果均完全相同，ABO血型相合22例，不合11例（主要不合5例，次要不合6例）。移植類型24例異基因外周血干細(xì)胞移植，供者為HLA完全相合的同胞，另9例為異基因骨髓移植。預(yù)處理方案對(duì)白血病患者采用經(jīng)典Cy+TBI： 環(huán)磷酰胺60 mg/ (kg·d)，連用2天，給美司鈉拮抗出血性膀胱炎，全身照射6-10 Gy，分2天進(jìn)行，肺受照劑量<

11、;8 Gy；1例急性再生障礙性貧血患者采用ATG+環(huán)磷酰胺；2例無血緣關(guān)系供者骨髓移植采用馬利蘭+阿糖胞苷+環(huán)磷酰胺；1例左乳低分化腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的患者采用氟達(dá)拉賓+環(huán)磷酰胺。供者造血干細(xì)胞采集allo-PBSCT供者應(yīng)用G-CSF 300 g/d，皮下注射，連用3天，第4天始行造血干細(xì)胞采集。干細(xì)胞均經(jīng)中心靜脈回輸給患者。對(duì)供者為O型或者受者為AB型的次要血型不和者，回輸過程中注意慢輸或稀釋后輸。對(duì)主要血型不合者為防止移植后溶血，用羥乙基淀粉沉降并且除去移植物中的紅細(xì)胞。全部患者接受全環(huán)境保護(hù)、血制品與細(xì)胞因子（G-CSF）應(yīng)用及營養(yǎng)支持治療。aGVHD的診斷及預(yù)防、治療方案 aGVHD的診

12、斷及分級(jí) 參照美國西雅圖Fred Hutchinson癌癥研究中心Thomas等于1975年提出的分級(jí)診斷方法。7例患者還進(jìn)行皮膚活檢取得病理學(xué)證據(jù)，5例出現(xiàn)腸道aGVHD的患者，均經(jīng)結(jié)腸鏡檢查及腸粘膜活檢取得病理學(xué)證據(jù)。預(yù)防方案  采用環(huán)孢霉素（CsA）以及短療程氨甲喋呤（MTX）方案。MTX的用法為移植后1天15 mg/m2靜脈滴注，移植后第 3、6、11天劑量為10 mg/m2 ； CsA用法為1.5-2 mg/ (kg·d)持續(xù)靜脈滴注24小時(shí)，時(shí)間為移植前1天到移植后30天。對(duì)環(huán)孢霉素A應(yīng)每周查濃度，最好根據(jù)血藥濃度調(diào)整用藥劑量，直至患者無嚴(yán)重胃腸癥狀后改為口服(

13、3  mg/kg)，依據(jù)情況維持、減量。治療aGVHD多用甲基強(qiáng)的松龍40 mg，2次/日，靜脈滴注，好轉(zhuǎn)后改口服強(qiáng)的松，并逐漸減量?；蛘哂盟赡荆‵K-506），劑量為0.03  mg/kg。樣品（血清標(biāo)本）收集按照靜脈采血的常規(guī)，定期地采集所有allo-HSCT的患者的外周血約3 ml，離心后分離血清，所有血清標(biāo)本置于1.5 ml  Eppendorf管中，編號(hào)之后儲(chǔ)存于-80冰箱內(nèi)。采血時(shí)間分別為：  移植前（7天左右）；  移植后每周抽取1次外周血，連續(xù)6-12周。    細(xì)胞因子檢測(cè)本次實(shí)驗(yàn)采

14、用放射免疫分析技術(shù)檢測(cè)33例患者移植前后血清的細(xì)胞因子（ IL-2、TNF-、IL-8、IL-10）的濃度，所采用的IL-2、TNF-、IL-8、IL-10放射免疫試劑盒為人細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，試劑盒來自解放軍總醫(yī)院生物化學(xué)研究所放射免疫室（原北京東亞免疫技術(shù)研究所）。取聚苯乙烯試管編號(hào)，按放射免疫藥盒加樣程序操作，加入分離劑后充分混勻，室溫放置20分鐘，4   500×g離心25分鐘，吸棄上清液，在自動(dòng)計(jì)數(shù)器上測(cè)放射性。本實(shí)驗(yàn)采用SN-682型放射免疫計(jì)數(shù)器，自動(dòng)計(jì)數(shù)，結(jié)果由SN-695型 gamma計(jì)數(shù)放射免疫自動(dòng)分析程序直接給出有關(guān)技術(shù)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣

15、品濃度ng/ml，并由相連的計(jì)算機(jī)打印出結(jié)果。植入證據(jù)供受者性別不同，采用性染色體觀察法；供受者ABO血型不同，觀察血型變化；供受者性別及血型均相同，采用PCR檢測(cè)DNA可變串重復(fù)序列。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用STATA計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，進(jìn)行計(jì)量資料t檢驗(yàn)。結(jié)果造血功能重建33例患者異基因移植后經(jīng)性染色體、ABO血型、DNA可變串重復(fù)序列檢查證實(shí)，均為供者型完全植入，均獲得造血功能重建。中性粒細(xì)胞恢復(fù)到0.5×109/L及血小板恢復(fù)到20×109/L的中位時(shí)間分別為移植后15（10-23）天及20（10

16、-66）天。 1      （version 9.00）.Variance analysis of the 2×2 factoral design was conducted for: ages; height; weight; anesthetic effect ratings; the period from anesthesia to operation, and Apgar scores of 1 minute after the fetus was taken out; SBP, DBP, HR, and SBP×

17、HR prior to and after anesthesia. t Test was conducted for intra-group comparison. 0.05.     1.8  Medical Ethics   It met the requirements of law and ethics to supplement with an intravenous drug in case of no or poor anesthetic effects, and was agreed by the Scien

18、tific & Technological Committee of our hospital.    2  Result    2.1  General Data  Variance analysis of the 2×2 factoral design was conducted for general data such as ages, weight, height, the period from anesthesia to operation, and Apgar score

19、s, value of P>0.05; in all inter-group comparisons, P>0.05 （Table 1）.Table 1  General Data of Maternal 1          （version 9.00）.Variance analysis of the 2×2 factoral design was conducted for: ages; height; weight; anesthetic effect ratings; the period from anesthesia to operation, and Apgar scores of 1 minute after the fetus was taken out; SBP, DBP, HR, and SBP×HR prior to and after anesthesia. t Test was conducted for intra-group comparison. 0.05.