異丙酚對體外循環(huán)患者核因子κB活性及整合素CD11b表達(dá)的影響

1、    異丙酚對體外循環(huán)患者核因子B活性及整合素CD11b表達(dá)的影響            作者：時間：2007-11-22 12:46:00                         

2、0;                 作者：蔡偉華， 曹殿青， 張曉春【摘要】  目的：觀察異丙酚對體外循環(huán)（CPB）患者中性粒細(xì)胞（PMN）核因子B（NF-B）活性及整合素CD11b表達(dá)的影響。 方法：將30例行CPB心瓣膜置換術(shù)病例隨機(jī)分成觀察組（異丙酚麻醉維持組）和對照組（咪唑安定麻醉維持組），每組30例。分別于麻醉前、CPB開始后30min、CPB停止后30min、4h、24h抽取撓動脈血3ml，運(yùn)用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)檢測

3、NF-B活性，流式細(xì)胞儀檢測CD11b表達(dá)水平。采用X2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的統(tǒng)計學(xué)分析，比較兩組間PMN NF-B活性和CD11b的表達(dá)。結(jié)果：兩組患者PMN NF-B活性在CPB停止后30min達(dá)到峰值，觀察組在CPB開始后30min、CPB停止后30min、4h、24h PMN NF-B活性低于對照組；兩組患者在CPB開始30min后 PMN CD11b表達(dá)水平呈遞增的趨勢，CPB停止后30min、4h、24h 3個時間點(diǎn)上觀察組PMN CD11b表達(dá)水平明顯低于對照組。結(jié)論：同咪唑安定相比，異丙酚可以減低CPB患者PMN NF-B活性和CD11b表達(dá)，明顯抑制體外循環(huán)患者炎癥反應(yīng)。

4、 【關(guān)鍵詞】  異丙酚； 心肺轉(zhuǎn)流術(shù)； 中性粒細(xì)胞； 核因子BEffects of Propofol on NF-B Activity and CD11b Expression of Polymorphonuclear Neutrophils in Patients Undergoing Cardiopulmonary BypassAbstract： Objective： To study the effects of propofol on the NF-B activity and CD11b expression of polymorphonuclear neutrophils

5、 in cardiopulmonary bypass (CPB) patients.  Method： Thirty ASA patients undergoing cardiac valve replacement surgery with CPB were randomly divided into two groups. Anesthesia was maintained with propofol in treatment group and with midazolam in control group. 3 milliliter radial artery blood w

6、as abstracted before induction of anesthesia, 30 min after CPB, 30 min, 4 hours and 24 hours after CPB finish. NF-B activity was tested in electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and expression of CD11b was measured in flow cytometry. The differences between the two groups at different five time

7、 points, including were analyzed with Chi-square test and t-test. Result： The peak value of NF-B activity was got 30 min after CPB. The NF-B activity in treatment group was lower than that in control group 30 min after CPB, 30 min, 4 hours and 24 hours after CPB finish. Expression of CD11b showed a

8、progressive rise in two groups at all the 5 time points in the study. The CD11b expression in treatment group was lower than that in control group on 30 min, 4 hours and 24 hours after CPB finish. Conclusion： Compared with traditional anesthesia with midazolam, propfol can reduce the activity of NK-

9、B and expression of CD11b and inhibit inflammatory reaction during CPB.Key words:  Propofol;  Cardiopulmonary bypass;  Polymorphonuclear neutrophils;  NF-B    心肺轉(zhuǎn)流術(shù)（cardiopulmonary bypass，CPB）可觸發(fā)一系列全身急性炎癥反應(yīng)（SIR），核因子B（nuclear factor-B，NF-B）是多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄和級聯(lián)放大過程的共

10、同通路和作用位點(diǎn)，該基因序列的活化可加重CPB及心臟缺血再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)程度1。中性粒細(xì)胞（PMN）與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附、易位進(jìn)入炎癥區(qū)域是PMN發(fā)揮其炎癥介導(dǎo)及損傷作用的關(guān)鍵步驟，其中PMN表面特異性的CD11b抗原是內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1唯一的結(jié)合配體。近年來的研究表明，異丙酚可以通過影響PMN的效應(yīng)作用、促/抗炎細(xì)胞因子水平、氧自由基和一氧化氮的產(chǎn)生等炎性反應(yīng)多個環(huán)節(jié)來防止過度失控的全身炎性反應(yīng)的發(fā)生2。本項(xiàng)研究擬通過比較不同麻醉維持方法的CPB患者PMN NF-B和CD11b的表達(dá)差異，探討異丙酚影響CPB引起的全身急性炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制及其在CPB中應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。1  材料

11、與方法1.1  一般資料：選取本院風(fēng)濕性心臟病于CPB下行心瓣膜置換術(shù)病例30例，ASA體格分級級，剔除術(shù)前有風(fēng)濕活動者，及合并冠心病、糖尿病、肝腎功能不全、呼吸系統(tǒng)疾病或感染性疾病，所有病例術(shù)前半年均未使用糖皮質(zhì)激素。隨機(jī)分成觀察組（異丙酚組）和對照組（咪唑安定組）各15例，兩組患者性別、年齡、體表面積、體外循環(huán)控制及主動脈阻斷時間（>30min）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，見表1）。表1  兩組CPB患者一般資料的比較略1.2  麻醉方法：麻醉前30min肌注嗎啡0.1mg/kg、東莨菪堿510g/kg。依次靜脈注推咪唑安定0.050.1mg/

12、kg，芬太尼510g/kg，維庫溴銨0.1mg/kg進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)；氣管插管后，使用Drager麻醉機(jī)機(jī)械通氣（潮氣量810ml/kg，呼吸頻率12次/min），維持動脈二氧化碳分壓3540mmHg。麻醉維持以吸入異氟醚、間斷靜脈注射維庫溴銨為主。分別于切皮前、CPB前追加芬太尼1015g/kg，芬太尼總量達(dá)3040g/kg，CPB前停異氟醚。觀察組于CPB前靜脈注射異丙酚l mg/kg后，以46mg/ 持續(xù)泵入，開放主動脈后改為3mg/維持至CPB結(jié)束。對照組CPB期間予咪唑安定0.10.2mg/kg，氟哌利多0.10.2mg/kg。應(yīng)用SarnsTM8000體外循環(huán)機(jī)，美國產(chǎn)成人型膜式氧合器

13、，預(yù)充量為1800 ml。轉(zhuǎn)流中氧濃度為65%70%，非搏動性灌注，維持紅細(xì)胞壓積（Hct）25%30%，鼻咽溫2628，灌注流量80l00mL/(kg·min)，維持平均動脈壓5080mmHg。阻斷升主動脈同時經(jīng)主動脈根部灌注4晶體停跳液1015ml/kg，以后間隔30min灌注冷血停跳液10ml/kg，維持心電呈等電位線。1.3  標(biāo)本采集和測定：分別在麻醉前（T1）、CPB開始后30min（T2）、CPB停止后30min（T3）、4h（T4）、24h（T5）從橈動脈無菌采3ml抗凝血備用。1.3.1  PMN NF-B活性測定：用抗凝血2.5ml按以下步驟進(jìn)

14、行：PMN的分離：采用密度梯度離心法分離PMN。臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢查細(xì)胞活力，結(jié)果純度>98%，存活率>95%。用無血清改良Eagles培養(yǎng)液(DMEM)懸浮PMN，配制PMN工作懸液1.0×109/ml。分離的PMN立即放入4冰箱保存。細(xì)胞核蛋白的提取3：將分離的PMN用40.1mol PBS液沖洗并離心，沉淀懸浮于200L 4裂解液（20mM HEPES pH7.9，10mM KCI, 0.1mM NaVanadate，1 mM EDTA, 10% Glycerol , 1 mM DTT，1 mM PMSF），研磨、離心后沉淀，并重復(fù)一次以上步驟，得到純凈的細(xì)胞核。沉淀

15、懸浮于200L 4裂解液（20mM HEPES pH7.9，10mM KCI，0.1mM NaVanadate，1mM EDTA， 20% Glycerol，0.42M NaCl, 1mM DTT，1 mM PMSF），離心取上清液，改良酚試劑法測定蛋白濃度，分裝，-80保存。序列寡核苷酸的同位素標(biāo)記：采用末端標(biāo)記法將NF-B的DNA結(jié)合位點(diǎn)（5-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3，3-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5）標(biāo)記-32PATP。用乙醇沉淀法去除未標(biāo)記寡核苷酸探針。Gel Shift Assay：將核蛋白提取物與同位素標(biāo)記的寡

16、核苷酸探針室溫下共同孵育30min，加1L10×點(diǎn)樣緩沖液，經(jīng)4%非變性聚丙烯酞胺凝膠恒壓電泳分離蛋白，剝離凝膠置真空干膠儀干燥，壓片，-80放射自顯影72h。沖洗X光片，灰度掃描，以積分灰度值表示NF-B的活性變化。1.3.2  用抗凝血0.5ml，采用流式細(xì)胞儀測定PMN CD11b的表達(dá)水平，結(jié)果用平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示。1.4  統(tǒng)計學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)錄入SAS8.0軟件包，以計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表    示，采用X2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有

17、統(tǒng)計學(xué)意義。2  結(jié)  果2.1  不同時間點(diǎn)兩組CPB患者PMN NF-B活性的比較：如表2所示，兩組患者PMN NF-B活性在CPB停止后30min達(dá)到峰值，觀察組在CPB開始后30min、CPB停止后30min、4h、24h PMN NF-B活性低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表2  不同時間點(diǎn)兩組CPB患者PMN NF-B活性比較（略）2.2  不同時間點(diǎn)兩組CPB患者PMN CD11b表達(dá)水平的比較：如表3所示，兩組患者在CPB開始后30min、CPB停止后30min、4h、24h PMN CD11b表達(dá)水平呈遞增的趨勢，CPB停止后3

18、0min、4h、24h 3個時間點(diǎn)上觀察組PMN CD11b表達(dá)水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表3  不同時間點(diǎn)兩組CPB患者PMN CD11b表達(dá)水平的比較（略）3  討  論體外循環(huán)心肺轉(zhuǎn)流（CPB）過程中，血液與循環(huán)管道等異物的直接接觸、CPB本身的非生理性灌注、手術(shù)創(chuàng)傷、腸道屏障功能的削弱、缺血再灌注損傷等均可觸發(fā)一系列急性炎癥反應(yīng)，與術(shù)后并發(fā)癥如呼吸衰竭、腎功能衰竭、凝血異常、多臟器功能衰竭的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。體外循環(huán)炎癥反應(yīng)的病理生理過程中產(chǎn)生的重要的細(xì)胞因子有IL-1、IL-2、IL-8、IL-10、TNF-、NO等，這些物質(zhì)可作用于IB蛋

19、白激酶（IKK），影響IB-的磷酸化降解，加速NF-B的活化；NF-B活化后易位入核又通過誘導(dǎo)靶基因，加快這些炎性因子的轉(zhuǎn)錄4。因此NF-B具有多向性調(diào)節(jié)功能，廣泛參與多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄和級聯(lián)放大過程。我們的實(shí)驗(yàn)測定了兩組不同麻醉方法的CPB患者PMN NF-B的表達(dá)活性，結(jié)果顯示兩組患者隨著CPB的啟動而PMN NF-B活性增高，并于CPB停止后30min達(dá)到表達(dá)峰值，說明CPB的啟動后，促進(jìn)PMN中的NF-B活化、轉(zhuǎn)移入核。研究表明，異丙酚可以減少PMN釋放促炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-，同時增加抗炎性細(xì)胞因子IL-1Ra、 IL-10的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子可以調(diào)控NF-B的

20、活化、轉(zhuǎn)錄過程，從而抑制NF-B的促炎作用2。同時，異丙酚因化學(xué)結(jié)構(gòu)類似Vit E的苯酚結(jié)構(gòu)而具有清除氧自由基的功能，對氧化應(yīng)激反應(yīng)中氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，膜結(jié)構(gòu)和膜流動性改變及細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載均具有阻斷作用。異丙酚能抑制PMN產(chǎn)生氧自由基并能有效清除過氧亞硝基陰離子，對氧化應(yīng)激所致的血管內(nèi)皮的損傷具有良好的保護(hù)作用5。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，較之使用咪唑安定麻醉維持的對照組，異丙酚組在CPB開始后30min、CPB停止后30min、4h和24h這4個時間點(diǎn)的NF-B活性均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明比較傳統(tǒng)麻醉用藥咪唑安定，異丙酚可以減低CPB患者PMN NF-

21、B的活性。血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞粘附是炎癥反應(yīng)的最初現(xiàn)象，也是中性粒細(xì)胞移行到血管外發(fā)揮其炎癥介導(dǎo)作用的首要步驟。研究證實(shí)，激活的白細(xì)胞如果不與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成粘附，其釋放產(chǎn)物對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷只是短暫的、可逆的，只有當(dāng)白細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上后，其釋放產(chǎn)物才能引起內(nèi)皮細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷與脫落6。本實(shí)驗(yàn)通過檢測CPB患者PMN CD11b的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CPB開始后30min、CPB停止后30min、4h、24h這4個時間點(diǎn)上，CD11b的表達(dá)水平隨著CPB的啟動呈遞增趨勢。這也與臨床所觀察到的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)多見于CPB術(shù)后448h一致。同時，我們通過比較使用異丙酚麻醉維持的觀察組和咪唑安定麻醉維

22、持的對照組兩組之間PMN CD11b表達(dá)的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CPB停止后30min、4h和24h這3個時間點(diǎn)上，觀察組CD11b的表達(dá)水平顯著低于對照組，表明同咪唑安定相比，異丙酚可以減低CPB患者PMN CD11b的表達(dá)，減少PMN與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。可能與異丙酚具有鈣通道阻滯作用2，及其對炎性細(xì)胞因子作用網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)及清除氧自由基作用有關(guān)。CPB可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞NF-B活性和整合素CD11b的表達(dá)增加。同咪唑安定相比，異丙酚可以減低中性粒細(xì)胞NF-B活性和整合素CD11b的表達(dá)，可能從減少中性粒細(xì)胞NF-B激活和減少與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附這兩個機(jī)制，調(diào)節(jié)CPB引發(fā)的全身急性炎癥反應(yīng)，因此更適于CPB麻醉維持。 【參考文獻(xiàn)】  1 尹光明,喻田,余志豪.