短暫性局灶性腦缺血再灌注后氯化鋰對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡

1、短暫性局灶性腦缺血再灌注后氯化鋰對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及糖原合成酶激酶(GSK)-3的影響 基金項(xiàng)目 國(guó)家人事部出國(guó)留學(xué)人員基金資助項(xiàng)目(ZA0001) ,南京醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(MC0005)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京210029；南京醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇 南京 210029王新河1，王斌2，錢燕寧1，通訊作者， E - mail: yanning _ qian摘要 目的：觀察大鼠短暫性局灶性腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及糖原合成酶激酶(GSK)-3含量和活性的變化并探討不同劑量氯化鋰的干預(yù)作用。方法：線栓大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCAO）,90分鐘后再

2、灌注制備腦缺血再灌注模型。SD大鼠126只，隨機(jī)分為正常(NO)組、假手術(shù)(SH)組、缺血再灌注(IR)組、氯化鋰1mmol/kg治療(Li1)組、氯化鋰2mmol/kg治療(Li2)組、氯化鋰3mmol/kg治療(Li3)組。NO組6只大鼠，其余各組按觀察時(shí)間點(diǎn)的不同(MCAO6小時(shí)、MCAO1天、MCAO3天、MCAO7天)分別再分為4個(gè)亞組，每亞組6只大鼠。Hoechst染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的變化，免疫熒光染色觀察海馬CA1區(qū)GSK -3含量和分布的改變，免疫熒光染色觀察海馬CA1區(qū)GSK-3的失活形式p-GSK-3（Ser9）含量和分布的變化。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)

3、差（±s）表示，以stata8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：Hoechst染色：與相同時(shí)間點(diǎn)SH組比較IR組細(xì)胞凋亡明顯(P<0.01)，以MCAO1天最為顯著(與MCAO6小時(shí)、3天、7天分別比較，P<0.01)。與相同時(shí)間點(diǎn)IR組比較各氯化鋰治療組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05或P<0.01) ,氯化鋰劑量越大，海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)減少越明顯(P<0.05或P<0.01)，但仍多于SH組(P<0.01)。GSK-3免疫熒光染色：各組大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)之間無(wú)顯著差異(P

4、>0.05)。NO組和SH組GSK-3主要集中于胞漿，核內(nèi)很少；IR組和各氯化鋰治療組有大量GSK-3分布于胞核，各組間GSK-3的分布無(wú)明顯差異。p-GSK-3（Ser9）免疫熒光染色：NO組和SH組僅在胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量p-GSK-3（Ser9）。與相同時(shí)間點(diǎn)SH組相比IR組p-GSK-3（Ser9）明顯增多，核內(nèi)增多更明顯(P<0.01)。與IR組比較氯化鋰治療后p-GSK-3（Ser9）增多更顯著 (P<0.01)，氯化鋰劑量越大，p-GSK-3（Ser9）增多越明顯(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：氯化鋰能劑量依賴性的減輕大鼠短暫性局灶性腦缺血后海馬CA

5、1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。增加海馬CA1區(qū)p-GSK-3(Ser9)表達(dá)，從而抑制GSK-3活性，這可能是氯化鋰抗凋亡作用的機(jī)制之一。關(guān)鍵詞 腦缺血；細(xì)胞凋亡；氯化鋰；GSK-3；大腦中動(dòng)脈閉塞Effects of lithium chloride on neuronal apoptosis and expression of glycogen synthase kinase (GSK)-3beta of hippocampal CA1 region after transient focal cerebral ischemia/reperfusion in ratsWANG Xin-he1 , WA

6、NG Bin2, QIAN Yan-ning1*(1Department of Anesthesiology，the First Afiliated Hospital of NJMU，Nanjing 210029 China； 2Department of Pharmacology, NJMU，Nanjing 210029，China)Abstract Objective: To observe the effect of lithium chloride on neuronal apoptosis and the expression and activity of glycogen syn

7、thase kinase (GSK)-3beta of hippocampal CA1 area after transient focal cerebral ischemia/reperfusion in rats. Methods：Occluded the right middle cerebral artery of rats with a 3-0 nylon suture for 90min,then the nylon suture was withdrawn and the ischemic brain tissue received blood reperfusion for v

8、arious times before death. SD rats were randomly divided into normal group(NO group),sham operation group(SH group)，ischemia/reperfusion group(IR group)，group treated with 1mmol/kg lithium chloride(Li1 group), group treated with 2mmol/kg lithium chloride(Li2 group),and group treated with 3mmol/kg li

9、thium chloride (Li3 group)Six rats were distributed to NO group. The last five groups were further divided into four subgroups respectively according to the time when they were killed, with six rats in each subgroupThe change of neuronal apoptosis in the CA 1 region was examined by Hoechst staining.

10、 The expression and distribution of GSK-3beta and p-GSK-3(Ser9）,which is the inactive form of GSK-3beta, in the cell was examined by immunofluorescence analysis. All values were expressed as means ± SD. Statistical analysis was performed using Stata8.0 software for one-way ANOVA, a value of 0.0

11、5 was considered to be statistically significant. Results： The apoptotic nuclei could be detected significantly in IR groups(Compare with SH groups, P<0.01), the peak of apoptosis was occurred around 1 day after MCAO, which was followed by a gradual decline at 3 days and 7 days. Compared to IR gr

12、oups, groups treating with lithium chloride dose dependently (13 mmol/kg) reduced the apoptotic nuclei in happocampal CA1 area. There was no visible difference among the total amounts of GSK-3beta in each group(P>0.05). But amounts of GSK-3beta transferred to nucleus from cytoplasm in IR and Li g

13、roups. P-GSK-3（Ser9）increased significantly, especially in nuclei, after reperfusion of middle cerebral artery(Compare with SH groups, P<0.01). Having been treated with lithium chloride, P-GSK-3（Ser9）increased even higher(Compare with IR groups, P<0.01).Also, dosage dependence increase of P-GS

14、K-3（Ser9）by lithium chloride could be seen Clearly. Conclusion：Lithium chloride can dose dependently (13 mmol/kg) suppress neuronal apoptosis and GSK-3 after MCAO/ reperfusion. The neuroprotective effect of lithium chloride might be correlated with its inhibition of GSK-3.Key words brain ischemia；ap

15、optosis；lithium chloride；GSK-3；Middle cerebral artery occlusion糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1,它可以激活p53基因表達(dá)P53蛋白2；可以抑制熱休克因子1（HSF1），使熱休克蛋白70（HSP70）表達(dá)下降3,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。9號(hào)位點(diǎn)絲氨酸殘基磷酸化后成為p-GSK-3(Ser9)，是GSK-3的失活形式4-6。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)鋰有抗神經(jīng)元凋亡的作用7-10。體外實(shí)驗(yàn)表明鋰可以直接或間接促進(jìn)GSK-3Ser9的磷酸化4, 11, 12，這可能是鋰抗神經(jīng)元凋亡的機(jī)制之一。但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中鋰與GSK-3的關(guān)

16、系鮮見(jiàn)報(bào)道。所以本研究自2005年10月2006年7月在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型上，觀察GSK-3及p-GSK-3(Ser9)的變化，以探討在體研究中鋰對(duì)GSK-3的影響。1.材料和方法 1.1材料 雄性SD大鼠，126只，清潔級(jí)，體重280320g，1822周齡，購(gòu)于江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。無(wú)水氯化鋰（美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)，南京大致生物科技有限公司分裝），Hoechst33258染色試劑盒（蘇州碧云天生物技術(shù)研究所），多克隆羊抗p-GSK-3（Ser9）（美國(guó)Santa cruz公司）,驢抗羊IgG-FITC(美國(guó)

17、Santa cruz公司),多克隆兔抗GSK-3(H-76)( 美國(guó)Santa cruz公司),抗兔Cy3免疫熒光染色試劑盒（蘇州碧云天生物技術(shù)研究所）。1.2方法1.2.1動(dòng)物分組SD大鼠126只，隨機(jī)分為正常組（NO組，n=6）、缺血再灌注組（IR組，n=24）、假手術(shù)組（SH組，n=24）、氯化鋰1組（Li1組，n=24）、氯化鋰2組（Li2組，n=24）、氯化鋰3組（Li3組，n=24）。除正常組外，其余各組按不同觀察時(shí)間點(diǎn)(MCAO6h、MCAO1d、MCAO3d、MCAO7d)再分為4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠。正常組不予任何處理，各氯化鋰組于再灌注后即刻用相應(yīng)劑量（1mmol/kg

18、、2mmol/kg、3mmol/kg）的氯化鋰腹腔注射，以后每24小時(shí)一次，直至處死。缺血再灌注組和假手術(shù)組以同等體積生理鹽水替代氯化鋰腹腔注射。1.2.2動(dòng)物模型與標(biāo)本采集 MCAO方法參考Longa EZ等13介紹的線栓法，略有改動(dòng)。2%戊巴比妥鈉0.25ml/100g腹腔注射麻醉后行右側(cè)MCAO，栓線深度20±3mm，90min后再灌注。監(jiān)測(cè)并控制肛溫在37±0.5。選清醒后左側(cè)肢體不能完全伸展或爬行時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒者入組。假手術(shù)組栓線深度小于15mm。各組大鼠在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，參照卞清明等8介紹的方法行升主動(dòng)脈插管灌注及固定。鼠腦于冰凍切片機(jī)中做冠狀切片，片厚10&#

19、181;m，每個(gè)鼠腦標(biāo)本于視交叉后1.7mm4mm（海馬齒狀回互包平面）隨機(jī)選擇6張切片作觀察。1.2.3 免疫熒光染色 24孔培養(yǎng)板中操作。常規(guī)間接染色法，F(xiàn)ITC、Cy3雙熒光標(biāo)記，一抗稀釋比均為1:100?？瞻讓?duì)照以PBS替代一抗。1.2.4 Hoechst凋亡染色 同張切片經(jīng)上述處理后，繼續(xù)于24孔培養(yǎng)板中行Hoechst33258染色，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。切片移至載玻片，抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下于海馬CA1區(qū)隨機(jī)取三個(gè)高倍（×400）視野，分別在紅、綠、藍(lán)三種熒光下觀察并拍照。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 照片以imageJ1.36b軟件處理分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)

20、7;標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以Stata 8.0做單因素方差分析，兩兩比較采用Scheffe法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1 Hoechst凋亡染色NO組與SH組擬缺血側(cè)海馬CA1區(qū)未見(jiàn)或偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞。與相同時(shí)點(diǎn)SH組比較，IR組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡明顯(P<0.01)， MCAO后1天凋亡細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰(P<0.01)。各Li組凋亡細(xì)胞比相同時(shí)點(diǎn)IR組明顯減少(P<0.01)，氯化鋰劑量越大，凋亡細(xì)胞減少越明顯(P<0.01)， 但仍多于SH組(P<0.01)（表1、圖1A）。表 1.各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)右側(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)（&

21、#177;s，n=6,個(gè)/0.1mm2)組別MCAO6小時(shí)MCAO1天MCAO3天MCAO7天NO 組SH 組IR 組Li1組Li2組Li3組0.7±0.80.7±0.814.3±1.0* +8.6±0.8* #6.2±0.8* # 6.0±0.9* #-0.5±0.621.8±0.7* 15.2±0.8* #12.5±1.1* # 10.5±0.6* #-0.7±0.816.6±0.8* +9.8±0.8* #8.2±0.8* # 6.5

22、77;0.6* #-0.8±0.812.3±0.8* +9.3±1.0* #6.8±0.8* # 5.7±0.8* #與SH組比較，*P<0.01；與IR組比較，#P<0.01；與Li1組比較，P<0.05，P<0.01；與Li2組比較，P<0.05，P<0.01；與MCAO1天比較，+P<0.012.2 p-GSK-3(Ser9)免疫熒光染色 NO組和SH組海馬CA1區(qū)僅在胞漿中可見(jiàn)少量的陽(yáng)性反應(yīng)，兩組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。IR組和各氯化鋰組海馬CA1區(qū)陽(yáng)性反應(yīng)顆粒均較相同時(shí)點(diǎn)SH組明

23、顯增多，且多分布于核內(nèi)(P<0.01)。各Li組的陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)均比相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的IR組明顯增多(P<0.01)，氯化鋰劑量越大，增多越明顯(P<0.05或P<0.01)（表2、圖1B）。2.3 GSK免疫熒光染色 各亞組大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3的陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)之間無(wú)顯著差別(P>0.05)。NO組和SH組陽(yáng)性反應(yīng)多位于胞漿。IR組和各Li組的陽(yáng)性反應(yīng)多位于細(xì)胞核，IR組和各Li組GSK-3陽(yáng)性反應(yīng)顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布無(wú)差異。(表3、圖1C)表 2.各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的右側(cè)海馬CA1區(qū)p-GSK-3(Ser9)陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)（±s，n=6,個(gè)/0.05mm2

24、）組別MCAO6小時(shí)MCAO1天MCAO3天MCAO7天NO 組SH 組IR 組Li1組Li2組Li3組24.0±8.327.5±8.987.5±7.5*124.7±13.7* #151.3±12.7*#181.7±8.6*#-27.2±8.9113.3±8.2*160.5±10.8* #185.3±12.6*#215.3±4.2*# -25.5±8.0154.0±11.4*204.0±12.5* #235.5±10.8*#257.8±

25、9.8* # -27.2±7.9201.0±9.9*235.8±5.2* #256.3±12.1*#280.2±11.9* # 與SH組比較，*P<0.01；與IR組比較，#P<0.01；與Li1組比較，P<0.05，P<0.01；與Li2組比較，P<0.05，P<0.01 表 3.各組大鼠在MCAO后各時(shí)間點(diǎn)的右側(cè)海馬CA1區(qū)GSK-3陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)（±s，n=6,個(gè)/0.05mm2）組別MCAO6小時(shí)MCAO1天MCAO3天MCAO7天NO 組SH 組IR 組Li1組Li2組Li3組626.3&

26、#177;38.7633.7±41.4619.2±36.7607.0±36.1623.8±34.9628.8±19.3-615.3±22.6609.2±36.2626.2±44.6656.3±39.0613.5±23.5-616.2±58.3648.8±46.5641.0±50.1596.5±31.4627.7±47.1-638.7±32.2630.3±26.2617.0±34.6595.0±45.2623

27、.0±36.73.討論 體內(nèi)和體外研究都發(fā)現(xiàn)鋰鹽有抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用7-9, 11, 14。為進(jìn)一步明確其機(jī)制，本研究采用MCAO再灌注模型，再灌注后腹腔注射氯化鋰。我們以往的研究15發(fā)現(xiàn)由于鋰本身的毒性作用，氯化鋰劑量不宜超過(guò)3mmol/Kg，這和Ren M等14的結(jié)果一致，所以選擇氯化鋰的劑量為1mmol/Kg、2mmol/Kg、3mmol/Kg。海馬CA1區(qū)屬缺血易損區(qū)，有利于觀察缺血造成的病理變化。IR組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)可見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞。各氯化鋰組海馬CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量均比相同時(shí)間點(diǎn)IR組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，隨著氯化鋰劑量的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。這提示腦

28、缺血再灌注后給予鋰鹽，仍可體現(xiàn)鋰鹽具有劑量依賴性的抗神經(jīng)元凋亡作用。 各組大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)之間無(wú)顯著差異。NO組和SH組GSK-3主要位于胞漿，核中較少；IR組和各氯化鋰組則有大量GSK-3分布于胞核?？梢?jiàn)，MCAO再灌注后,GSK-3蛋白合成量沒(méi)有改變，主要變化是GSK-3由胞漿到核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，這可能因?yàn)槎鄶?shù)凋亡調(diào)節(jié)因子位于核內(nèi),GSK-3必須移位到核中才能影響它們的作用。應(yīng)用氯化鋰后，GSK-3陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)和胞內(nèi)的分布與IR組比較無(wú)顯著差異，說(shuō)明氯化鋰對(duì)GSK-3的合成量和GSK-3漿核遷移過(guò)程均無(wú)影響。P-GSK-3(Ser9)是GSK-3的失活形式，其含量代表G

29、SK-3的活性4, 5。NO組和SH組p-GSK-3(Ser9)含量很少，且多見(jiàn)于細(xì)胞漿中。IR組p-GSK-3(Ser9) 比SH組顯著增多。說(shuō)明MCAO后機(jī)體可能為了減少神經(jīng)元凋亡而抑制了GSK-3的活性。Li1、Li2、Li3組p-GSK-3(Ser9)含量均比相同時(shí)間點(diǎn)IR組明顯增多，氯化鋰的劑量越大，p-GSK-3(Ser9)陽(yáng)性反應(yīng)顆粒數(shù)越多。這說(shuō)明氯化鋰可以促進(jìn)GSK-3Ser9位點(diǎn)的磷酸化。鋰促進(jìn)GSK-3的Ser9磷酸化的具體機(jī)制尚不確定，體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：鋰通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)，后者又激活蛋白激酶B(Akt) 16或蛋白激酶C(PKC) 4,Akt和PKC

30、可以磷酸化GSK-3的Ser9。鋰也可直接作用于GSK-312，磷酸化其Ser9從而抑制其活性。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)MCAO后，氯化鋰可以顯著增加大鼠海馬Akt的活性15，Akt極可能是GSK-3的上游調(diào)節(jié)因子17。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大鼠MCAO后，氯化鋰對(duì)GSK-3的合成量沒(méi)有影響，但氯化鋰可以劑量依賴性的促進(jìn)海馬CA1區(qū)的GSK-3Ser9位點(diǎn)的磷酸化，從而抑制了GSK-3的活性。這可能是鋰抗神經(jīng)元凋亡作用的機(jī)制之一。圖1. MCAO1天IR和Li3組大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞核的Hoechst染色（A1、A2） Li3組凋亡細(xì)胞數(shù)（A2）顯著少于IR組（A1）；p-GSK-3(Ser9)免疫

31、熒光染色（B1、B2） Li3組p-GSK-3(Ser9)陽(yáng)性顆粒數(shù)（B2）顯著多于IR組（B1）；GSK-3免疫熒光染色（C1、C2） GSK-3陽(yáng)性顆粒數(shù)兩組之間無(wú)顯著差異（×400）參考文獻(xiàn)1Parker PJ, Caudwell FB, Cohen P. Glycogen synthase from rabbit skeletal muscle; effect of insulin on the state of phosphorylation of the seven phosphoserine residues in vivoJ. Eur J Biochem, 1983;

32、130(1):227-34.2Qu L, Huang S, Baltzis D, et al. Endoplasmic reticulum stress induces p53 cytoplasmic localization and prevents p53-dependent apoptosis by a pathway involving glycogen synthase kinase-3betaJ. Genes Dev, 2004;18(3):261-77.3Xavier IJ, Mercier PA, McLoughlin CM, et al. Glycogen synthase

33、kinase 3beta negatively regulates both DNA-binding and transcriptional activities of heat shock factor 1J. J Biol Chem, 2000;275(37):29147-52.4Kirshenboim N, Plotkin B, Shlomo SB, et al. Lithium-mediated phosphorylation of glycogen synthase kinase-3beta involves PI3 kinase-dependent activation of pr

34、otein kinase C-alphaJ. J Mol Neurosci, 2004;24(2):237-45.5Stambolic V, Woodgett JR. Mitogen inactivation of glycogen synthase kinase-3 beta in intact cells via serine 9 phosphorylationJ. Biochem J, 1994;303 ( Pt 3):701-4.6Habas A, Kharebava G, Szatmari E, et al. NMDA neuroprotection against a phosph

35、atidylinositol-3 kinase inhibitor, LY294002 by NR2B-mediated suppression of glycogen synthase kinase-3beta-induced apoptosisJ. J Neurochem, 2006;96(2):335-48.7施韜1, 錢燕寧1, 王斌2,等. 氯化鋰預(yù)處理對(duì)沙土鼠前腦缺血保護(hù)作用的病理觀察J. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2003,23(3): 243-245,T001.8卞清明1, 錢燕寧1, 王斌2,等. 沙土鼠前腦缺血后海馬P53蛋白的表達(dá)及氯化鋰的干預(yù)作用J. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2004,24(2): 165-167,F003.9卞清明2, 錢燕寧1. 氯化鋰對(duì)沙土鼠前腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及磷酸化Akt蛋白表達(dá)的影響J. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2005,25(8): 540-543,F002.10Hughes K, Nikolakaki E, Plyte SE, et al. Modulation of the glycogen synthase kinase-3 family by tyrosine phosphorylationJ. EMBO J,