麻醉學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文利用rna干擾技術(shù)抑制p2x,3受體基因表達(dá)治療骨癌痛的實(shí)驗(yàn)研究

1、麻醉學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 利用RNA干擾技術(shù)抑制P2X<,3>受體基因表達(dá)治療骨癌痛的實(shí)驗(yàn)研究關(guān)鍵詞：骨癌痛 背根神經(jīng)節(jié) RNA干擾 鞘內(nèi)注射 慢病毒載體 基因治療摘要：P2X3受體是ATP-門(mén)控性離子通道家族的一個(gè)亞型，在慢性疼痛的傷害性信息傳遞中起重要作用，由于P2X3受體的分布僅限于感覺(jué)神經(jīng)元，對(duì)該通道的處理就可能提供一個(gè)即鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)又無(wú)副作用的慢性疼痛的治療方法。本研究在大鼠脛骨癌痛模型上研究P2X3受體在骨癌痛發(fā)生機(jī)理中的作用，并利用RNA干擾技術(shù)以P2X3受體為靶點(diǎn)探討基因治療慢性疼痛的可行性。 第一部分、骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中P2X3受體基因表達(dá)及電流的變化 目的

2、：制備大鼠骨癌痛模型，觀察骨癌痛大鼠觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值的變化，檢測(cè)骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)的變化及P2X3受體ATP誘發(fā)電流的變化。 方法：大鼠骨癌痛模型的建立及行為學(xué)測(cè)定：雌性SD大鼠18只，隨機(jī)分為2組(n=9)，即骨癌痛組：左側(cè)脛骨內(nèi)注射5ul(104/ul)walker256肉瘤細(xì)胞，右側(cè)不予處理；對(duì)照組：左側(cè)脛骨注射同劑量的生理鹽水，右側(cè)不予處理。接種腫瘤細(xì)胞后5d，10d，14d，21d觀察感覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏閾值的變化。感覺(jué)異常以Von Frey細(xì)絲觸誘發(fā)痛閾值(g)表示；痛覺(jué)過(guò)敏閾值用CO2激光刺激痛閾值(ms)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察

3、有無(wú)淋巴結(jié)或其他臟器的轉(zhuǎn)移。取雙側(cè)脛骨、肺做病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的生長(zhǎng)及臟器的轉(zhuǎn)移。以大鼠出現(xiàn)明顯觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值降低，且病理切片證實(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作為癌痛模型成功指標(biāo)。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體表達(dá)的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，RT-PCR方法檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，免疫印跡法檢測(cè)P2X3受體蛋白表達(dá)的變化。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜即免疫印跡結(jié)果用熒光掃描分析儀分析，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶的輝度和內(nèi)參照-actin的輝度之比來(lái)計(jì)算。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體誘發(fā)電流的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組

4、大鼠L4-6DRG，急性分散，全細(xì)胞膜片鉗記錄方法比較噴射給予，-meATP3M后P2X3受體誘發(fā)電流的變化。 結(jié)果：接種腫瘤細(xì)胞10d后，骨癌痛組大鼠觸左側(cè)誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值開(kāi)始降低(P0.05)，此后疼痛癥狀進(jìn)行性加重。接種14d，21d骨癌痛組大鼠左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較右側(cè)明顯降低(P0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值相比顯著降低(P0.01)。觀察期間對(duì)照組大鼠和骨癌痛組大鼠右側(cè)觸誘發(fā)痛閾值及CO2激光熱痛敏閾值均沒(méi)有明顯變化。大鼠接種細(xì)胞后21d行脛骨病理切片可見(jiàn)腫瘤組織在骨髓腔內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，破壞骨質(zhì)。接種腫瘤細(xì)胞21d骨癌痛

5、組大鼠DRG中P2X3mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)(P0.01)。骨癌痛組大鼠P2X3受體誘發(fā)電流峰值為1.4±0.23 nA(n=5)，對(duì)照組大鼠為0.8±0.12 nA(n=5)，二者相比有顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論：脛骨內(nèi)接種Walker256細(xì)胞可以成功制備骨癌性疼痛動(dòng)物模型，用于癌癥性疼痛的機(jī)制及治療研究；大鼠骨癌痛模型中P2X3受體轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均上調(diào)，P2X3受體電流增強(qiáng)，通道數(shù)目增加，提示該通道參與了骨癌痛的發(fā)生過(guò)程。 第二部分、抑制P2X3受體基因表達(dá)的慢病毒shRNA的構(gòu)建 目的：本實(shí)驗(yàn)利用可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA的真核載體構(gòu)建了若

6、干針對(duì)P2X3受體不同基因靶位的RNA干擾質(zhì)粒，并篩選出其中特異性抑制效果最強(qiáng)的基因靶序列，構(gòu)建慢病毒RNA干擾載體。 方法：根據(jù)RNA干擾的原理及siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3段長(zhǎng)度為19bp的P2X3基因特異性siRNA，編號(hào)分別為782，850，918，構(gòu)建至pSR-GFP siRNA轉(zhuǎn)錄載體；同時(shí)，將P2X3全長(zhǎng)基因克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。用pEGFP-P2X3質(zhì)粒分別與pSR-782、 pSR-850、 pSR-918 RNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞并提取RNA，通過(guò)RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)P2X3基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，篩選出抑制效果最佳的siRNA干

7、擾質(zhì)粒。選擇抑制效果最佳的850片段構(gòu)建慢病毒顆粒，所用載體為PRNAT-u6.2載體，克隆位點(diǎn)為BamH1/Xhol。載體測(cè)序后進(jìn)行病毒顆粒的大量包裝和純化，用定量PCR法測(cè)定病毒滴度。用包裝好的慢病毒顆粒感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，觀測(cè)感染效率。用包裝好的慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞，Immunblot檢測(cè)P2X3受體的表達(dá)水平。 結(jié)果：通過(guò)將siRNA質(zhì)粒與表達(dá)P2X3蛋白的pEGFP-P2X3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，從設(shè)計(jì)的3條siRNA序列中篩選獲得具有最佳抑制效果的psR-850 P2X3 RNA干擾質(zhì)粒。將shRNA850片段克隆至PRNAT-u6.2慢病毒載體，經(jīng)過(guò)病毒包裝、純化，測(cè)定出病

8、毒滴度為5.3×108Tu/ml。慢病毒顆?？梢杂行Ц腥竞ｑR神經(jīng)元細(xì)胞，感染效率幾乎為100慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞后能顯著抑制P2X3蛋白的表達(dá)，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2，5，10時(shí)，蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的54、28、17，而對(duì)GADPH表達(dá)沒(méi)有明顯抑制。 結(jié)論：利用體外轉(zhuǎn)錄合成的P2X3受體shRNA850片段可以高效抑制P2X3基因的表達(dá)，用慢病毒顆粒包裝后可以高效率感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，證明慢病毒包裝的shRNA可有效應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)元P2X3受體基因沉默的研究。 第三部分、鞘內(nèi)注射慢病毒shRNA抑制P2X3受體基因表達(dá)對(duì)大鼠骨癌痛的影響 目的：研究鞘內(nèi)注射慢病毒包裝的P

9、2X3受體shRNA對(duì)骨癌痛模型大鼠觸誘發(fā)痛及熱痛敏閾值的影響，對(duì)P2x3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及受體蛋白表達(dá)的影響，并觀察慢病毒shRNA注射后的長(zhǎng)期毒副作用。 方法：SD大鼠31只，隨機(jī)分為5組，正常組和骨癌痛組每組5只，治療組和陰性對(duì)照治療組每組8只，另外5只正常大鼠鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒用于觀察慢病毒顆粒的毒副作用。正常組為正常大鼠；骨癌痛組為骨癌性疼痛大鼠，未做任何治療；治療組于癌痛模型10d，大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏后鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)；陰性對(duì)照治療組于癌痛模型10d后鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照shRNA慢病毒顆粒10l(5×

10、106Tu)。在鞘內(nèi)注射后3d、1w、2w、3w、4w、6w分別觀察大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光熱痛敏閾值。于第6w行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后取L4-6DRG，RF-PCR及Immunoblot檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)，方法同第一部分。正常大鼠5只鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)，6w后處死取脊髓、DRG、肺、肝、腎、心臟，HE染色，常規(guī)病理觀察慢病毒顆粒的毒副作用。 結(jié)果：鞘內(nèi)注射1w時(shí)，治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組和陰性對(duì)照治療組顯著升高(P0.01)，但仍低于正常組(P0.01)；鞘內(nèi)注射2w后治療組大鼠觸誘發(fā)

11、痛閾值和CO2激光痛閾值與造模前正常痛閾值相比無(wú)顯著性差異(P0.05)，與同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組及陰性對(duì)照治療組相比均顯著增高(P0.01)，這種作用可持續(xù)至鞘內(nèi)給藥后6w。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒，可顯著降低治療組大鼠DRG中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)(P0.01)。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒對(duì)重要臟器在觀察期內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒副作用。 結(jié)論：鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒在六周的觀察期內(nèi)可有效緩解骨癌痛大鼠的觸誘發(fā)痛和痛覺(jué)過(guò)敏，沉默DRG中P2X3基因的表達(dá)，同時(shí)觀察期內(nèi)重要臟器無(wú)病理改變。正文內(nèi)容 P2X3受體是ATP-門(mén)控性離子通道家族的一個(gè)亞型，在慢性疼痛的

12、傷害性信息傳遞中起重要作用，由于P2X3受體的分布僅限于感覺(jué)神經(jīng)元，對(duì)該通道的處理就可能提供一個(gè)即鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)又無(wú)副作用的慢性疼痛的治療方法。本研究在大鼠脛骨癌痛模型上研究P2X3受體在骨癌痛發(fā)生機(jī)理中的作用，并利用RNA干擾技術(shù)以P2X3受體為靶點(diǎn)探討基因治療慢性疼痛的可行性。 第一部分、骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中P2X3受體基因表達(dá)及電流的變化 目的：制備大鼠骨癌痛模型，觀察骨癌痛大鼠觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值的變化，檢測(cè)骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)的變化及P2X3受體ATP誘發(fā)電流的變化。 方法：大鼠骨癌痛模型的建立及行為學(xué)測(cè)定：雌性SD大鼠18只，隨機(jī)分為

13、2組(n=9)，即骨癌痛組：左側(cè)脛骨內(nèi)注射5ul(104/ul)walker256肉瘤細(xì)胞，右側(cè)不予處理；對(duì)照組：左側(cè)脛骨注射同劑量的生理鹽水，右側(cè)不予處理。接種腫瘤細(xì)胞后5d，10d，14d，21d觀察感覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏閾值的變化。感覺(jué)異常以Von Frey細(xì)絲觸誘發(fā)痛閾值(g)表示；痛覺(jué)過(guò)敏閾值用CO2激光刺激痛閾值(ms)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察有無(wú)淋巴結(jié)或其他臟器的轉(zhuǎn)移。取雙側(cè)脛骨、肺做病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的生長(zhǎng)及臟器的轉(zhuǎn)移。以大鼠出現(xiàn)明顯觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值降低，且病理切片證實(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作為癌痛模型成功指標(biāo)。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體表達(dá)的變化：接種腫瘤細(xì)胞后2

14、1d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，RT-PCR方法檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，免疫印跡法檢測(cè)P2X3受體蛋白表達(dá)的變化。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜即免疫印跡結(jié)果用熒光掃描分析儀分析，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶的輝度和內(nèi)參照-actin的輝度之比來(lái)計(jì)算。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體誘發(fā)電流的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，急性分散，全細(xì)胞膜片鉗記錄方法比較噴射給予，-meATP3M后P2X3受體誘發(fā)電流的變化。 結(jié)果：接種腫瘤細(xì)胞10d后，骨癌痛組大鼠觸左側(cè)誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值開(kāi)始降低(P0.05)，此后疼痛癥狀進(jìn)行性加重。接種14d，21

15、d骨癌痛組大鼠左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較右側(cè)明顯降低(P0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值相比顯著降低(P0.01)。觀察期間對(duì)照組大鼠和骨癌痛組大鼠右側(cè)觸誘發(fā)痛閾值及CO2激光熱痛敏閾值均沒(méi)有明顯變化。大鼠接種細(xì)胞后21d行脛骨病理切片可見(jiàn)腫瘤組織在骨髓腔內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，破壞骨質(zhì)。接種腫瘤細(xì)胞21d骨癌痛組大鼠DRG中P2X3mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)(P0.01)。骨癌痛組大鼠P2X3受體誘發(fā)電流峰值為1.4±0.23 nA(n=5)，對(duì)照組大鼠為0.8±0.12 nA(n=5)，二者相比有顯著性差異(P0.0

16、1)。 結(jié)論：脛骨內(nèi)接種Walker256細(xì)胞可以成功制備骨癌性疼痛動(dòng)物模型，用于癌癥性疼痛的機(jī)制及治療研究；大鼠骨癌痛模型中P2X3受體轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均上調(diào)，P2X3受體電流增強(qiáng)，通道數(shù)目增加，提示該通道參與了骨癌痛的發(fā)生過(guò)程。 第二部分、抑制P2X3受體基因表達(dá)的慢病毒shRNA的構(gòu)建 目的：本實(shí)驗(yàn)利用可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA的真核載體構(gòu)建了若干針對(duì)P2X3受體不同基因靶位的RNA干擾質(zhì)粒，并篩選出其中特異性抑制效果最強(qiáng)的基因靶序列，構(gòu)建慢病毒RNA干擾載體。 方法：根據(jù)RNA干擾的原理及siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3段長(zhǎng)度為19bp的P2X3基因特異性siRNA，編號(hào)分別為782，850，

17、918，構(gòu)建至pSR-GFP siRNA轉(zhuǎn)錄載體；同時(shí)，將P2X3全長(zhǎng)基因克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。用pEGFP-P2X3質(zhì)粒分別與pSR-782、 pSR-850、 pSR-918 RNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞并提取RNA，通過(guò)RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)P2X3基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，篩選出抑制效果最佳的siRNA干擾質(zhì)粒。選擇抑制效果最佳的850片段構(gòu)建慢病毒顆粒，所用載體為PRNAT-u6.2載體，克隆位點(diǎn)為BamH1/Xhol。載體測(cè)序后進(jìn)行病毒顆粒的大量包裝和純化，用定量PCR法測(cè)定病毒滴度。用包裝好的慢病毒顆粒感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，觀測(cè)感染效率。用包裝好

18、的慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞，Immunblot檢測(cè)P2X3受體的表達(dá)水平。 結(jié)果：通過(guò)將siRNA質(zhì)粒與表達(dá)P2X3蛋白的pEGFP-P2X3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，從設(shè)計(jì)的3條siRNA序列中篩選獲得具有最佳抑制效果的psR-850 P2X3 RNA干擾質(zhì)粒。將shRNA850片段克隆至PRNAT-u6.2慢病毒載體，經(jīng)過(guò)病毒包裝、純化，測(cè)定出病毒滴度為5.3×108Tu/ml。慢病毒顆?？梢杂行Ц腥竞ｑR神經(jīng)元細(xì)胞，感染效率幾乎為100慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞后能顯著抑制P2X3蛋白的表達(dá)，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2，5，10時(shí)，蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的54、28、17，而對(duì)GADP

19、H表達(dá)沒(méi)有明顯抑制。 結(jié)論：利用體外轉(zhuǎn)錄合成的P2X3受體shRNA850片段可以高效抑制P2X3基因的表達(dá)，用慢病毒顆粒包裝后可以高效率感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，證明慢病毒包裝的shRNA可有效應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)元P2X3受體基因沉默的研究。 第三部分、鞘內(nèi)注射慢病毒shRNA抑制P2X3受體基因表達(dá)對(duì)大鼠骨癌痛的影響 目的：研究鞘內(nèi)注射慢病毒包裝的P2X3受體shRNA對(duì)骨癌痛模型大鼠觸誘發(fā)痛及熱痛敏閾值的影響，對(duì)P2x3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及受體蛋白表達(dá)的影響，并觀察慢病毒shRNA注射后的長(zhǎng)期毒副作用。 方法：SD大鼠31只，隨機(jī)分為5組，正常組和骨癌痛組每組5只，治療組和陰性對(duì)照治療組每組8

20、只，另外5只正常大鼠鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒用于觀察慢病毒顆粒的毒副作用。正常組為正常大鼠；骨癌痛組為骨癌性疼痛大鼠，未做任何治療；治療組于癌痛模型10d，大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏后鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)；陰性對(duì)照治療組于癌痛模型10d后鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照shRNA慢病毒顆粒10l(5×106Tu)。在鞘內(nèi)注射后3d、1w、2w、3w、4w、6w分別觀察大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光熱痛敏閾值。于第6w行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后取L4-6DRG，RF-PCR及Immunoblot檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)，方法同第一部分。正常

21、大鼠5只鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)，6w后處死取脊髓、DRG、肺、肝、腎、心臟，HE染色，常規(guī)病理觀察慢病毒顆粒的毒副作用。 結(jié)果：鞘內(nèi)注射1w時(shí)，治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組和陰性對(duì)照治療組顯著升高(P0.01)，但仍低于正常組(P0.01)；鞘內(nèi)注射2w后治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值與造模前正常痛閾值相比無(wú)顯著性差異(P0.05)，與同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組及陰性對(duì)照治療組相比均顯著增高(P0.01)，這種作用可持續(xù)至鞘內(nèi)給藥后6w。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒，可顯著降低治療組大鼠DRG中P2X3受體m

22、RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)(P0.01)。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒對(duì)重要臟器在觀察期內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒副作用。 結(jié)論：鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒在六周的觀察期內(nèi)可有效緩解骨癌痛大鼠的觸誘發(fā)痛和痛覺(jué)過(guò)敏，沉默DRG中P2X3基因的表達(dá)，同時(shí)觀察期內(nèi)重要臟器無(wú)病理改變。P2X3受體是ATP-門(mén)控性離子通道家族的一個(gè)亞型，在慢性疼痛的傷害性信息傳遞中起重要作用，由于P2X3受體的分布僅限于感覺(jué)神經(jīng)元，對(duì)該通道的處理就可能提供一個(gè)即鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)又無(wú)副作用的慢性疼痛的治療方法。本研究在大鼠脛骨癌痛模型上研究P2X3受體在骨癌痛發(fā)生機(jī)理中的作用，并利用RNA干擾技術(shù)以P2X3受體為靶點(diǎn)探討基因治療

23、慢性疼痛的可行性。 第一部分、骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中P2X3受體基因表達(dá)及電流的變化 目的：制備大鼠骨癌痛模型，觀察骨癌痛大鼠觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值的變化，檢測(cè)骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)的變化及P2X3受體ATP誘發(fā)電流的變化。 方法：大鼠骨癌痛模型的建立及行為學(xué)測(cè)定：雌性SD大鼠18只，隨機(jī)分為2組(n=9)，即骨癌痛組：左側(cè)脛骨內(nèi)注射5ul(104/ul)walker256肉瘤細(xì)胞，右側(cè)不予處理；對(duì)照組：左側(cè)脛骨注射同劑量的生理鹽水，右側(cè)不予處理。接種腫瘤細(xì)胞后5d，10d，14d，21d觀察感覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏閾值的變化。感覺(jué)異常以Von Frey

24、細(xì)絲觸誘發(fā)痛閾值(g)表示；痛覺(jué)過(guò)敏閾值用CO2激光刺激痛閾值(ms)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察有無(wú)淋巴結(jié)或其他臟器的轉(zhuǎn)移。取雙側(cè)脛骨、肺做病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的生長(zhǎng)及臟器的轉(zhuǎn)移。以大鼠出現(xiàn)明顯觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值降低，且病理切片證實(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作為癌痛模型成功指標(biāo)。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體表達(dá)的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，RT-PCR方法檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，免疫印跡法檢測(cè)P2X3受體蛋白表達(dá)的變化。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜即免疫印跡結(jié)果用熒光掃描分析儀分析，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶的輝度和內(nèi)參照-actin的輝度之比來(lái)計(jì)

25、算。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體誘發(fā)電流的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，急性分散，全細(xì)胞膜片鉗記錄方法比較噴射給予，-meATP3M后P2X3受體誘發(fā)電流的變化。 結(jié)果：接種腫瘤細(xì)胞10d后，骨癌痛組大鼠觸左側(cè)誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值開(kāi)始降低(P0.05)，此后疼痛癥狀進(jìn)行性加重。接種14d，21d骨癌痛組大鼠左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較右側(cè)明顯降低(P0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值相比顯著降低(P0.01)。觀察期間對(duì)照組大鼠和骨癌痛組大鼠右側(cè)觸誘發(fā)痛閾值及CO2激光熱痛敏閾值均沒(méi)有明顯變化。大鼠接種細(xì)胞

26、后21d行脛骨病理切片可見(jiàn)腫瘤組織在骨髓腔內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，破壞骨質(zhì)。接種腫瘤細(xì)胞21d骨癌痛組大鼠DRG中P2X3mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)(P0.01)。骨癌痛組大鼠P2X3受體誘發(fā)電流峰值為1.4±0.23 nA(n=5)，對(duì)照組大鼠為0.8±0.12 nA(n=5)，二者相比有顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論：脛骨內(nèi)接種Walker256細(xì)胞可以成功制備骨癌性疼痛動(dòng)物模型，用于癌癥性疼痛的機(jī)制及治療研究；大鼠骨癌痛模型中P2X3受體轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均上調(diào)，P2X3受體電流增強(qiáng)，通道數(shù)目增加，提示該通道參與了骨癌痛的發(fā)生過(guò)程。 第二部分、抑制P2X3受

27、體基因表達(dá)的慢病毒shRNA的構(gòu)建 目的：本實(shí)驗(yàn)利用可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA的真核載體構(gòu)建了若干針對(duì)P2X3受體不同基因靶位的RNA干擾質(zhì)粒，并篩選出其中特異性抑制效果最強(qiáng)的基因靶序列，構(gòu)建慢病毒RNA干擾載體。 方法：根據(jù)RNA干擾的原理及siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3段長(zhǎng)度為19bp的P2X3基因特異性siRNA，編號(hào)分別為782，850，918，構(gòu)建至pSR-GFP siRNA轉(zhuǎn)錄載體；同時(shí)，將P2X3全長(zhǎng)基因克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。用pEGFP-P2X3質(zhì)粒分別與pSR-782、 pSR-850、 pSR-918 RNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞并提取RNA

28、，通過(guò)RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)P2X3基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，篩選出抑制效果最佳的siRNA干擾質(zhì)粒。選擇抑制效果最佳的850片段構(gòu)建慢病毒顆粒，所用載體為PRNAT-u6.2載體，克隆位點(diǎn)為BamH1/Xhol。載體測(cè)序后進(jìn)行病毒顆粒的大量包裝和純化，用定量PCR法測(cè)定病毒滴度。用包裝好的慢病毒顆粒感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，觀測(cè)感染效率。用包裝好的慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞，Immunblot檢測(cè)P2X3受體的表達(dá)水平。 結(jié)果：通過(guò)將siRNA質(zhì)粒與表達(dá)P2X3蛋白的pEGFP-P2X3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，從設(shè)計(jì)的3條siRNA序列中篩選獲得具有最佳抑制效果的psR-850 P2X3 RNA干擾質(zhì)粒

29、。將shRNA850片段克隆至PRNAT-u6.2慢病毒載體，經(jīng)過(guò)病毒包裝、純化，測(cè)定出病毒滴度為5.3×108Tu/ml。慢病毒顆?？梢杂行Ц腥竞ｑR神經(jīng)元細(xì)胞，感染效率幾乎為100慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞后能顯著抑制P2X3蛋白的表達(dá)，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2，5，10時(shí)，蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的54、28、17，而對(duì)GADPH表達(dá)沒(méi)有明顯抑制。 結(jié)論：利用體外轉(zhuǎn)錄合成的P2X3受體shRNA850片段可以高效抑制P2X3基因的表達(dá)，用慢病毒顆粒包裝后可以高效率感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，證明慢病毒包裝的shRNA可有效應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)元P2X3受體基因沉默的研究。 第三部分、鞘內(nèi)注射慢

30、病毒shRNA抑制P2X3受體基因表達(dá)對(duì)大鼠骨癌痛的影響 目的：研究鞘內(nèi)注射慢病毒包裝的P2X3受體shRNA對(duì)骨癌痛模型大鼠觸誘發(fā)痛及熱痛敏閾值的影響，對(duì)P2x3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及受體蛋白表達(dá)的影響，并觀察慢病毒shRNA注射后的長(zhǎng)期毒副作用。 方法：SD大鼠31只，隨機(jī)分為5組，正常組和骨癌痛組每組5只，治療組和陰性對(duì)照治療組每組8只，另外5只正常大鼠鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒用于觀察慢病毒顆粒的毒副作用。正常組為正常大鼠；骨癌痛組為骨癌性疼痛大鼠，未做任何治療；治療組于癌痛模型10d，大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏后鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)；

31、陰性對(duì)照治療組于癌痛模型10d后鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照shRNA慢病毒顆粒10l(5×106Tu)。在鞘內(nèi)注射后3d、1w、2w、3w、4w、6w分別觀察大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光熱痛敏閾值。于第6w行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后取L4-6DRG，RF-PCR及Immunoblot檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)，方法同第一部分。正常大鼠5只鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)，6w后處死取脊髓、DRG、肺、肝、腎、心臟，HE染色，常規(guī)病理觀察慢病毒顆粒的毒副作用。 結(jié)果：鞘內(nèi)注射1w時(shí)，治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組和陰性對(duì)照

32、治療組顯著升高(P0.01)，但仍低于正常組(P0.01)；鞘內(nèi)注射2w后治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值與造模前正常痛閾值相比無(wú)顯著性差異(P0.05)，與同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組及陰性對(duì)照治療組相比均顯著增高(P0.01)，這種作用可持續(xù)至鞘內(nèi)給藥后6w。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒，可顯著降低治療組大鼠DRG中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)(P0.01)。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒對(duì)重要臟器在觀察期內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒副作用。 結(jié)論：鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒在六周的觀察期內(nèi)可有效緩解骨癌痛大鼠的觸誘發(fā)痛和痛覺(jué)過(guò)敏，沉默DRG中P2X3基因的表達(dá)，同時(shí)觀察期內(nèi)重要

33、臟器無(wú)病理改變。P2X3受體是ATP-門(mén)控性離子通道家族的一個(gè)亞型，在慢性疼痛的傷害性信息傳遞中起重要作用，由于P2X3受體的分布僅限于感覺(jué)神經(jīng)元，對(duì)該通道的處理就可能提供一個(gè)即鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)又無(wú)副作用的慢性疼痛的治療方法。本研究在大鼠脛骨癌痛模型上研究P2X3受體在骨癌痛發(fā)生機(jī)理中的作用，并利用RNA干擾技術(shù)以P2X3受體為靶點(diǎn)探討基因治療慢性疼痛的可行性。 第一部分、骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中P2X3受體基因表達(dá)及電流的變化 目的：制備大鼠骨癌痛模型，觀察骨癌痛大鼠觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值的變化，檢測(cè)骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)的變化及P2X3受體ATP誘發(fā)電

34、流的變化。 方法：大鼠骨癌痛模型的建立及行為學(xué)測(cè)定：雌性SD大鼠18只，隨機(jī)分為2組(n=9)，即骨癌痛組：左側(cè)脛骨內(nèi)注射5ul(104/ul)walker256肉瘤細(xì)胞，右側(cè)不予處理；對(duì)照組：左側(cè)脛骨注射同劑量的生理鹽水，右側(cè)不予處理。接種腫瘤細(xì)胞后5d，10d，14d，21d觀察感覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏閾值的變化。感覺(jué)異常以Von Frey細(xì)絲觸誘發(fā)痛閾值(g)表示；痛覺(jué)過(guò)敏閾值用CO2激光刺激痛閾值(ms)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察有無(wú)淋巴結(jié)或其他臟器的轉(zhuǎn)移。取雙側(cè)脛骨、肺做病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的生長(zhǎng)及臟器的轉(zhuǎn)移。以大鼠出現(xiàn)明顯觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值降低，且病理切片證實(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

35、作為癌痛模型成功指標(biāo)。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體表達(dá)的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，RT-PCR方法檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，免疫印跡法檢測(cè)P2X3受體蛋白表達(dá)的變化。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜即免疫印跡結(jié)果用熒光掃描分析儀分析，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶的輝度和內(nèi)參照-actin的輝度之比來(lái)計(jì)算。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體誘發(fā)電流的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，急性分散，全細(xì)胞膜片鉗記錄方法比較噴射給予，-meATP3M后P2X3受體誘發(fā)電流的變化。 結(jié)果：接種腫瘤細(xì)胞10d后，骨癌痛組大鼠觸左側(cè)誘發(fā)痛閾值和

36、CO2激光痛閾值開(kāi)始降低(P0.05)，此后疼痛癥狀進(jìn)行性加重。接種14d，21d骨癌痛組大鼠左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較右側(cè)明顯降低(P0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值相比顯著降低(P0.01)。觀察期間對(duì)照組大鼠和骨癌痛組大鼠右側(cè)觸誘發(fā)痛閾值及CO2激光熱痛敏閾值均沒(méi)有明顯變化。大鼠接種細(xì)胞后21d行脛骨病理切片可見(jiàn)腫瘤組織在骨髓腔內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，破壞骨質(zhì)。接種腫瘤細(xì)胞21d骨癌痛組大鼠DRG中P2X3mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)(P0.01)。骨癌痛組大鼠P2X3受體誘發(fā)電流峰值為1.4±0.23 nA(n=5)，對(duì)照組

37、大鼠為0.8±0.12 nA(n=5)，二者相比有顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論：脛骨內(nèi)接種Walker256細(xì)胞可以成功制備骨癌性疼痛動(dòng)物模型，用于癌癥性疼痛的機(jī)制及治療研究；大鼠骨癌痛模型中P2X3受體轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均上調(diào)，P2X3受體電流增強(qiáng)，通道數(shù)目增加，提示該通道參與了骨癌痛的發(fā)生過(guò)程。 第二部分、抑制P2X3受體基因表達(dá)的慢病毒shRNA的構(gòu)建 目的：本實(shí)驗(yàn)利用可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA的真核載體構(gòu)建了若干針對(duì)P2X3受體不同基因靶位的RNA干擾質(zhì)粒，并篩選出其中特異性抑制效果最強(qiáng)的基因靶序列，構(gòu)建慢病毒RNA干擾載體。 方法：根據(jù)RNA干擾的原理及siRNA的設(shè)計(jì)原則，

38、設(shè)計(jì)3段長(zhǎng)度為19bp的P2X3基因特異性siRNA，編號(hào)分別為782，850，918，構(gòu)建至pSR-GFP siRNA轉(zhuǎn)錄載體；同時(shí)，將P2X3全長(zhǎng)基因克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。用pEGFP-P2X3質(zhì)粒分別與pSR-782、 pSR-850、 pSR-918 RNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞并提取RNA，通過(guò)RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)P2X3基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，篩選出抑制效果最佳的siRNA干擾質(zhì)粒。選擇抑制效果最佳的850片段構(gòu)建慢病毒顆粒，所用載體為PRNAT-u6.2載體，克隆位點(diǎn)為BamH1/Xhol。載體測(cè)序后進(jìn)行病毒顆粒的大量包裝和純化，用定量PC

39、R法測(cè)定病毒滴度。用包裝好的慢病毒顆粒感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，觀測(cè)感染效率。用包裝好的慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞，Immunblot檢測(cè)P2X3受體的表達(dá)水平。 結(jié)果：通過(guò)將siRNA質(zhì)粒與表達(dá)P2X3蛋白的pEGFP-P2X3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，從設(shè)計(jì)的3條siRNA序列中篩選獲得具有最佳抑制效果的psR-850 P2X3 RNA干擾質(zhì)粒。將shRNA850片段克隆至PRNAT-u6.2慢病毒載體，經(jīng)過(guò)病毒包裝、純化，測(cè)定出病毒滴度為5.3×108Tu/ml。慢病毒顆?？梢杂行Ц腥竞ｑR神經(jīng)元細(xì)胞，感染效率幾乎為100慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞后能顯著抑制P2X3蛋白的表達(dá)，感染復(fù)數(shù)(

40、MOI)為2，5，10時(shí)，蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的54、28、17，而對(duì)GADPH表達(dá)沒(méi)有明顯抑制。 結(jié)論：利用體外轉(zhuǎn)錄合成的P2X3受體shRNA850片段可以高效抑制P2X3基因的表達(dá)，用慢病毒顆粒包裝后可以高效率感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，證明慢病毒包裝的shRNA可有效應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)元P2X3受體基因沉默的研究。 第三部分、鞘內(nèi)注射慢病毒shRNA抑制P2X3受體基因表達(dá)對(duì)大鼠骨癌痛的影響 目的：研究鞘內(nèi)注射慢病毒包裝的P2X3受體shRNA對(duì)骨癌痛模型大鼠觸誘發(fā)痛及熱痛敏閾值的影響，對(duì)P2x3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及受體蛋白表達(dá)的影響，并觀察慢病毒shRNA注射后的長(zhǎng)期毒副作用。 方法：SD

41、大鼠31只，隨機(jī)分為5組，正常組和骨癌痛組每組5只，治療組和陰性對(duì)照治療組每組8只，另外5只正常大鼠鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒用于觀察慢病毒顆粒的毒副作用。正常組為正常大鼠；骨癌痛組為骨癌性疼痛大鼠，未做任何治療；治療組于癌痛模型10d，大鼠出現(xiàn)明顯的痛覺(jué)過(guò)敏后鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)；陰性對(duì)照治療組于癌痛模型10d后鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照shRNA慢病毒顆粒10l(5×106Tu)。在鞘內(nèi)注射后3d、1w、2w、3w、4w、6w分別觀察大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光熱痛敏閾值。于第6w行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后取L4-6DRG，RF-PCR及Imm

42、unoblot檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)，方法同第一部分。正常大鼠5只鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)，6w后處死取脊髓、DRG、肺、肝、腎、心臟，HE染色，常規(guī)病理觀察慢病毒顆粒的毒副作用。 結(jié)果：鞘內(nèi)注射1w時(shí)，治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組和陰性對(duì)照治療組顯著升高(P0.01)，但仍低于正常組(P0.01)；鞘內(nèi)注射2w后治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值與造模前正常痛閾值相比無(wú)顯著性差異(P0.05)，與同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組及陰性對(duì)照治療組相比均顯著增高(P0.01)，這種作用可持續(xù)至鞘內(nèi)給藥后6w

43、。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒，可顯著降低治療組大鼠DRG中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)(P0.01)。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒對(duì)重要臟器在觀察期內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒副作用。 結(jié)論：鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒在六周的觀察期內(nèi)可有效緩解骨癌痛大鼠的觸誘發(fā)痛和痛覺(jué)過(guò)敏，沉默DRG中P2X3基因的表達(dá)，同時(shí)觀察期內(nèi)重要臟器無(wú)病理改變。P2X3受體是ATP-門(mén)控性離子通道家族的一個(gè)亞型，在慢性疼痛的傷害性信息傳遞中起重要作用，由于P2X3受體的分布僅限于感覺(jué)神經(jīng)元，對(duì)該通道的處理就可能提供一個(gè)即鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)又無(wú)副作用的慢性疼痛的治療方法。本研究在大鼠脛骨癌痛模型上研究P2X3受

44、體在骨癌痛發(fā)生機(jī)理中的作用，并利用RNA干擾技術(shù)以P2X3受體為靶點(diǎn)探討基因治療慢性疼痛的可行性。 第一部分、骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中P2X3受體基因表達(dá)及電流的變化 目的：制備大鼠骨癌痛模型，觀察骨癌痛大鼠觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值的變化，檢測(cè)骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)的變化及P2X3受體ATP誘發(fā)電流的變化。 方法：大鼠骨癌痛模型的建立及行為學(xué)測(cè)定：雌性SD大鼠18只，隨機(jī)分為2組(n=9)，即骨癌痛組：左側(cè)脛骨內(nèi)注射5ul(104/ul)walker256肉瘤細(xì)胞，右側(cè)不予處理；對(duì)照組：左側(cè)脛骨注射同劑量的生理鹽水，右側(cè)不予處理。接種腫瘤細(xì)胞后5d，1

45、0d，14d，21d觀察感覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏閾值的變化。感覺(jué)異常以Von Frey細(xì)絲觸誘發(fā)痛閾值(g)表示；痛覺(jué)過(guò)敏閾值用CO2激光刺激痛閾值(ms)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察有無(wú)淋巴結(jié)或其他臟器的轉(zhuǎn)移。取雙側(cè)脛骨、肺做病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的生長(zhǎng)及臟器的轉(zhuǎn)移。以大鼠出現(xiàn)明顯觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值降低，且病理切片證實(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作為癌痛模型成功指標(biāo)。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體表達(dá)的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，RT-PCR方法檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，免疫印跡法檢測(cè)P2X3受體蛋白表達(dá)的變化。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜即免疫印跡結(jié)果用熒光

46、掃描分析儀分析，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶的輝度和內(nèi)參照-actin的輝度之比來(lái)計(jì)算。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體誘發(fā)電流的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，急性分散，全細(xì)胞膜片鉗記錄方法比較噴射給予，-meATP3M后P2X3受體誘發(fā)電流的變化。 結(jié)果：接種腫瘤細(xì)胞10d后，骨癌痛組大鼠觸左側(cè)誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值開(kāi)始降低(P0.05)，此后疼痛癥狀進(jìn)行性加重。接種14d，21d骨癌痛組大鼠左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較右側(cè)明顯降低(P0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值相比顯著降低(P0.01)。觀察期間對(duì)照組大鼠

47、和骨癌痛組大鼠右側(cè)觸誘發(fā)痛閾值及CO2激光熱痛敏閾值均沒(méi)有明顯變化。大鼠接種細(xì)胞后21d行脛骨病理切片可見(jiàn)腫瘤組織在骨髓腔內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，破壞骨質(zhì)。接種腫瘤細(xì)胞21d骨癌痛組大鼠DRG中P2X3mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)(P0.01)。骨癌痛組大鼠P2X3受體誘發(fā)電流峰值為1.4±0.23 nA(n=5)，對(duì)照組大鼠為0.8±0.12 nA(n=5)，二者相比有顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論：脛骨內(nèi)接種Walker256細(xì)胞可以成功制備骨癌性疼痛動(dòng)物模型，用于癌癥性疼痛的機(jī)制及治療研究；大鼠骨癌痛模型中P2X3受體轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均上調(diào)，P2X3受體電流

48、增強(qiáng)，通道數(shù)目增加，提示該通道參與了骨癌痛的發(fā)生過(guò)程。 第二部分、抑制P2X3受體基因表達(dá)的慢病毒shRNA的構(gòu)建 目的：本實(shí)驗(yàn)利用可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA的真核載體構(gòu)建了若干針對(duì)P2X3受體不同基因靶位的RNA干擾質(zhì)粒，并篩選出其中特異性抑制效果最強(qiáng)的基因靶序列，構(gòu)建慢病毒RNA干擾載體。 方法：根據(jù)RNA干擾的原理及siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3段長(zhǎng)度為19bp的P2X3基因特異性siRNA，編號(hào)分別為782，850，918，構(gòu)建至pSR-GFP siRNA轉(zhuǎn)錄載體；同時(shí)，將P2X3全長(zhǎng)基因克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。用pEGFP-P2X3質(zhì)粒分別與pSR-782、 pSR-850、 p

49、SR-918 RNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞并提取RNA，通過(guò)RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)P2X3基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，篩選出抑制效果最佳的siRNA干擾質(zhì)粒。選擇抑制效果最佳的850片段構(gòu)建慢病毒顆粒，所用載體為PRNAT-u6.2載體，克隆位點(diǎn)為BamH1/Xhol。載體測(cè)序后進(jìn)行病毒顆粒的大量包裝和純化，用定量PCR法測(cè)定病毒滴度。用包裝好的慢病毒顆粒感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，觀測(cè)感染效率。用包裝好的慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞，Immunblot檢測(cè)P2X3受體的表達(dá)水平。 結(jié)果：通過(guò)將siRNA質(zhì)粒與表達(dá)P2X3蛋白的pEGFP-P2X3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，從設(shè)計(jì)的3條s

50、iRNA序列中篩選獲得具有最佳抑制效果的psR-850 P2X3 RNA干擾質(zhì)粒。將shRNA850片段克隆至PRNAT-u6.2慢病毒載體，經(jīng)過(guò)病毒包裝、純化，測(cè)定出病毒滴度為5.3×108Tu/ml。慢病毒顆?？梢杂行Ц腥竞ｑR神經(jīng)元細(xì)胞，感染效率幾乎為100慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞后能顯著抑制P2X3蛋白的表達(dá)，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2，5，10時(shí)，蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的54、28、17，而對(duì)GADPH表達(dá)沒(méi)有明顯抑制。 結(jié)論：利用體外轉(zhuǎn)錄合成的P2X3受體shRNA850片段可以高效抑制P2X3基因的表達(dá)，用慢病毒顆粒包裝后可以高效率感染海馬神經(jīng)元細(xì)胞，證明慢病毒包裝的shR

51、NA可有效應(yīng)用于哺乳動(dòng)物神經(jīng)元P2X3受體基因沉默的研究。 第三部分、鞘內(nèi)注射慢病毒shRNA抑制P2X3受體基因表達(dá)對(duì)大鼠骨癌痛的影響 目的：研究鞘內(nèi)注射慢病毒包裝的P2X3受體shRNA對(duì)骨癌痛模型大鼠觸誘發(fā)痛及熱痛敏閾值的影響，對(duì)P2x3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平及受體蛋白表達(dá)的影響，并觀察慢病毒shRNA注射后的長(zhǎng)期毒副作用。 方法：SD大鼠31只，隨機(jī)分為5組，正常組和骨癌痛組每組5只，治療組和陰性對(duì)照治療組每組8只，另外5只正常大鼠鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒用于觀察慢病毒顆粒的毒副作用。正常組為正常大鼠；骨癌痛組為骨癌性疼痛大鼠，未做任何治療；治療組于癌痛模型10d，大鼠出現(xiàn)明顯的

52、痛覺(jué)過(guò)敏后鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)；陰性對(duì)照治療組于癌痛模型10d后鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照shRNA慢病毒顆粒10l(5×106Tu)。在鞘內(nèi)注射后3d、1w、2w、3w、4w、6w分別觀察大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光熱痛敏閾值。于第6w行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后取L4-6DRG，RF-PCR及Immunoblot檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)，方法同第一部分。正常大鼠5只鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒10l(5×106Tu)，6w后處死取脊髓、DRG、肺、肝、腎、心臟，HE染色，常規(guī)病理觀察慢病毒顆粒的毒副作用。 結(jié)果：鞘內(nèi)注

53、射1w時(shí)，治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組和陰性對(duì)照治療組顯著升高(P0.01)，但仍低于正常組(P0.01)；鞘內(nèi)注射2w后治療組大鼠觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值與造模前正常痛閾值相比無(wú)顯著性差異(P0.05)，與同一時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組及陰性對(duì)照治療組相比均顯著增高(P0.01)，這種作用可持續(xù)至鞘內(nèi)給藥后6w。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒，可顯著降低治療組大鼠DRG中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)(P0.01)。鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒對(duì)重要臟器在觀察期內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒副作用。 結(jié)論：鞘內(nèi)注射shRNA850慢病毒顆粒在六周的觀察期內(nèi)可有效緩解

54、骨癌痛大鼠的觸誘發(fā)痛和痛覺(jué)過(guò)敏，沉默DRG中P2X3基因的表達(dá)，同時(shí)觀察期內(nèi)重要臟器無(wú)病理改變。P2X3受體是ATP-門(mén)控性離子通道家族的一個(gè)亞型，在慢性疼痛的傷害性信息傳遞中起重要作用，由于P2X3受體的分布僅限于感覺(jué)神經(jīng)元，對(duì)該通道的處理就可能提供一個(gè)即鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)又無(wú)副作用的慢性疼痛的治療方法。本研究在大鼠脛骨癌痛模型上研究P2X3受體在骨癌痛發(fā)生機(jī)理中的作用，并利用RNA干擾技術(shù)以P2X3受體為靶點(diǎn)探討基因治療慢性疼痛的可行性。 第一部分、骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)中P2X3受體基因表達(dá)及電流的變化 目的：制備大鼠骨癌痛模型，觀察骨癌痛大鼠觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值的變化，檢測(cè)骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)(

55、DRG)中P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)的變化及P2X3受體ATP誘發(fā)電流的變化。 方法：大鼠骨癌痛模型的建立及行為學(xué)測(cè)定：雌性SD大鼠18只，隨機(jī)分為2組(n=9)，即骨癌痛組：左側(cè)脛骨內(nèi)注射5ul(104/ul)walker256肉瘤細(xì)胞，右側(cè)不予處理；對(duì)照組：左側(cè)脛骨注射同劑量的生理鹽水，右側(cè)不予處理。接種腫瘤細(xì)胞后5d，10d，14d，21d觀察感覺(jué)異常和痛覺(jué)過(guò)敏閾值的變化。感覺(jué)異常以Von Frey細(xì)絲觸誘發(fā)痛閾值(g)表示；痛覺(jué)過(guò)敏閾值用CO2激光刺激痛閾值(ms)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察有無(wú)淋巴結(jié)或其他臟器的轉(zhuǎn)移。取雙側(cè)脛骨、肺做病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤的生長(zhǎng)

56、及臟器的轉(zhuǎn)移。以大鼠出現(xiàn)明顯觸誘發(fā)痛和熱痛敏閾值降低，且病理切片證實(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作為癌痛模型成功指標(biāo)。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體表達(dá)的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，RT-PCR方法檢測(cè)P2X3受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，免疫印跡法檢測(cè)P2X3受體蛋白表達(dá)的變化。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜即免疫印跡結(jié)果用熒光掃描分析儀分析，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶的輝度和內(nèi)參照-actin的輝度之比來(lái)計(jì)算。骨癌痛大鼠DRG中P2X3受體誘發(fā)電流的變化：接種腫瘤細(xì)胞后21d，取骨癌痛組和對(duì)照組大鼠L4-6DRG，急性分散，全細(xì)胞膜片鉗記錄方法比較噴射給予，-meATP3M后P2X3

57、受體誘發(fā)電流的變化。 結(jié)果：接種腫瘤細(xì)胞10d后，骨癌痛組大鼠觸左側(cè)誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值開(kāi)始降低(P0.05)，此后疼痛癥狀進(jìn)行性加重。接種14d，21d骨癌痛組大鼠左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值較右側(cè)明顯降低(P0.01)；與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組左側(cè)的觸誘發(fā)痛閾值和CO2激光痛閾值相比顯著降低(P0.01)。觀察期間對(duì)照組大鼠和骨癌痛組大鼠右側(cè)觸誘發(fā)痛閾值及CO2激光熱痛敏閾值均沒(méi)有明顯變化。大鼠接種細(xì)胞后21d行脛骨病理切片可見(jiàn)腫瘤組織在骨髓腔內(nèi)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，破壞骨質(zhì)。接種腫瘤細(xì)胞21d骨癌痛組大鼠DRG中P2X3mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)較對(duì)照組均明顯增強(qiáng)(P0.01)。骨癌痛組

58、大鼠P2X3受體誘發(fā)電流峰值為1.4±0.23 nA(n=5)，對(duì)照組大鼠為0.8±0.12 nA(n=5)，二者相比有顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論：脛骨內(nèi)接種Walker256細(xì)胞可以成功制備骨癌性疼痛動(dòng)物模型，用于癌癥性疼痛的機(jī)制及治療研究；大鼠骨癌痛模型中P2X3受體轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)均上調(diào)，P2X3受體電流增強(qiáng)，通道數(shù)目增加，提示該通道參與了骨癌痛的發(fā)生過(guò)程。 第二部分、抑制P2X3受體基因表達(dá)的慢病毒shRNA的構(gòu)建 目的：本實(shí)驗(yàn)利用可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA的真核載體構(gòu)建了若干針對(duì)P2X3受體不同基因靶位的RNA干擾質(zhì)粒，并篩選出其中特異性抑制效果最強(qiáng)的基因靶序列

59、，構(gòu)建慢病毒RNA干擾載體。 方法：根據(jù)RNA干擾的原理及siRNA的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3段長(zhǎng)度為19bp的P2X3基因特異性siRNA，編號(hào)分別為782，850，918，構(gòu)建至pSR-GFP siRNA轉(zhuǎn)錄載體；同時(shí)，將P2X3全長(zhǎng)基因克隆至pEGFP-N1真核表達(dá)載體。用pEGFP-P2X3質(zhì)粒分別與pSR-782、 pSR-850、 pSR-918 RNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞并提取RNA，通過(guò)RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)P2X3基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，篩選出抑制效果最佳的siRNA干擾質(zhì)粒。選擇抑制效果最佳的850片段構(gòu)建慢病毒顆粒，所用載體為PRNAT-u6.2載體，克隆位點(diǎn)為BamH1/Xhol。載體測(cè)序后進(jìn)行病毒顆粒的大量包裝和純化，用定量PCR法測(cè)定病毒滴度。用包裝好