轉(zhuǎn)化生長因子β1在超壓力負(fù)荷肥厚心肌中的表達(dá)及Losartan干預(yù)

1、    轉(zhuǎn)化生長因子1在超壓力負(fù)荷肥厚心肌中 的表達(dá)及Losartan干預(yù)        摘要本研究旨在探討轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF-1)在左室肥厚發(fā)生、發(fā)展中的作用及與血管緊張素(Ang)關(guān)系，以及Losartan對左室肥厚的干預(yù)作用。應(yīng)用放射免疫分析法及免疫組化方法測定腹主動脈縮窄后心肌組織Ang水平、TGF-1的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)腹主動脈縮窄后心肌組織Ang水平及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性升高(P0.01)，TGF-1在心肌細(xì)胞胞漿中的表達(dá)顯著增加(P0.01)

2、，術(shù)后第7天達(dá)最高峰，在胞核的表達(dá)顯著減少(P0.01)，術(shù)后第14天時核表達(dá)陰性，左室肥厚病理改變明顯。應(yīng)用Ang型受體拮抗劑Losartan后，胞漿TGF-1表達(dá)下降，核表達(dá)增加，陽性率由術(shù)前的23%增加到43%，左室肥厚被抑制。提示TGF-1參與左室肥厚的發(fā)生、發(fā)展，在胞漿的表達(dá)可能促進(jìn)肥厚，在胞核的表達(dá)可能抑制肥厚，并受血管緊張素調(diào)控，應(yīng)用Losartan能有效抑制左室肥厚。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)化生長因子1左室肥厚血管緊張素受體 Expression of Transforming Growth Factor-betal in Cardiomyocytes During Pressure Over

3、load-induced Hypertrophy and the Effect of Losartan on ItTang Bing,Liu Shiyu,Su Xiaohua,et al.(Department of Cardiology,Chengdu Army General Hospital,Chengdu610083)AbstractTo study the role of transforming growth factor-betal (TGF-1) in cardiac hypertrophy and the connection of angietensis (Ang ) wi

4、th it.Cardiac muscle Ang was measured by radioimmunoassay;Subcellar distribution of TGF-1 in cardiomyocytes was examined by immunohistochemistry after abdominal aorta constriction.The results showed that the levels of Ang、the activities of angiotensin-converting enzyme and ratios of heart weight to

5、body weight were significantly increased after abdominal aorta constriction (P0.01).Expression of TGF-1 in cardiomyocytes cytoplasm increased significantly and reached peak at d7 post-operation;But in nuclei,the expression decreased and disappeared at d14 post-operation (P0.01).Trearment with low do

6、se losartan (5mg/kg,selective angiotensin typel receptor antagonist),Carotid blood pressures were not different from coarctation (P0.05).Ratios of heart weight to body weight were significantly decreased.The expression of TGF-1 decreased rapidly in cytoplasm and increased from 23% to 43% in nuclei(P

7、0.01).We concluded that TGF-1 involve in the development of cardiac hypertrophy,it possible promote cardiac hypertrophy in cytoplasm and suppress cardiac hypertrophy in nuclei.The role of Ang in the development of cardiac hypertrophy may be mediated by TGF-1.Losartan can effectively block cardiac hy

8、pertrophy.Key words:Transforming growth factor-betal; Cardiac hypertrophy; Angiotensin ;Receptor左室肥厚是高血壓、冠心病、心力衰竭的重要病理生理改變，與心血管疾病預(yù)后密切相關(guān)1。對其發(fā)生機(jī)制及防治的研究就顯得尤為重要。當(dāng)前關(guān)于左室肥厚與心肌局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)關(guān)系的研究頗多，但其中具體的信號傳遞系統(tǒng)尚不清楚。本研究通過觀察TGF-1在超壓力負(fù)荷肥厚心肌中的表達(dá)變化及血管緊張素型受體拮抗劑Losartan對其的影響，探討TGF-1在左室肥厚發(fā)生、發(fā)展中的作用及與血管緊張素的關(guān)系，以及Losart

9、an對左室肥厚的干預(yù)作用，這在國內(nèi)鮮有報道。材料與方法一、主要材料Losartan(科素亞，美國默沙東公司)，轉(zhuǎn)化生長因子1多克隆抗體(購于北京中山生物公司，Santa Cruz公司產(chǎn)品)，Spkit試劑盒(購于邁新公司，Zymed公司產(chǎn)品)，血管緊張素測定試劑盒(購于北方生物技術(shù)研究所)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)活性測定試劑盒(購于海軍總醫(yī)院)，其它試劑為國產(chǎn)分析純。二、動物模型及分組超壓力負(fù)荷肥厚心肌模型采用腹主動脈縮窄法2。雌雄各半的Wistar大鼠，體重250300g，4%戊巴比妥(40mg/kg)腹腔麻醉，在左上腹膈肌下，雙側(cè)腎動脈上方游離腹主動脈，沿腹主動脈長軸置直徑為0.7mm

10、的小圓棒(7號針頭磨制)，用“3-0”號絲線結(jié)扎腹主動脈及小圓棒，再抽出小圓棒，使腹主動脈殘留直徑為0.7mm殘腔，造成腹主動脈狹窄。假手術(shù)組動物除不用絲線結(jié)扎外，所有步驟均與手術(shù)組相同。將72只動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(對照組)、手術(shù)組和給藥組(Losartan 5mg/kg*d-1灌胃給藥從術(shù)前4天至術(shù)后2周)，分別有術(shù)后3天、7天、14天組，每組8只。三、檢測指標(biāo)(一)標(biāo)本制備大鼠稱重、麻醉，頸動脈插管記錄頸動脈內(nèi)壓力，取血2ml置入盛有2-巰基丙醇20ul、8-羥基喹啉10ul、10%依地酸二鈉20ul的抗凝試管，測定血漿Ang 。大鼠斷頭處死后，開胸取出心臟，立即用0.02M磷酸鹽緩沖液

11、(pH 7.4)灌洗至流出液無血色為止，沿房室環(huán)剪去心房，沿室間隔剪去右心室，保留室間隔，左心室肌以濾紙吸干，稱重后置液氮罐。左室重量指數(shù)=左室重量(mg)/體重(g)。(二)生化測定心肌組織Ang 含量測定采用放射免疫分析法，按試劑盒說明書操作。心肌組織ACE活性測定采用紫外分光光度法，按試劑盒說明書操作。(三)TGF-1免疫組化染色及其結(jié)果半定量4%多聚甲醛固定好的左心室肌標(biāo)本用石蠟包埋后連續(xù)取2張切片(厚5m)分別HE染色及TGF-1免疫組化染色(ABC法)。步驟：脫蠟、水化。0.3%過氧化氫甲醇液滅活內(nèi)源性過氧化物酶?？乖瓱嵝迯?fù)后10%正常山羊血清封閉非特異性染色。滴加適當(dāng)稀釋的第一抗

12、體(1100稀釋)，4過夜。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(1300稀釋)，37孵育30min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親合素(1300稀釋)，37孵育30min。滴加DAB-H2O2顯色液，于顯微鏡下監(jiān)測顯色。最后蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片。在像分析儀上測定TGF-1陽性信號面積和陽性信號平均灰度值(取5個高倍視野)，計算陽性信號指數(shù)。陽性信號指數(shù)=陽性信號面積×陽性信號平均灰度/測定面積×100，并計算每個視野中TGF-1核表達(dá)陽性的計數(shù)，取均數(shù)。(四)病理學(xué)檢查常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞變性、壞死、增生，淋巴、單核細(xì)胞浸潤及肉芽腫形成、間質(zhì)增生情況。四、統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以

13、平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗。結(jié)果一、血壓、左室重量指數(shù)的變化手術(shù)組術(shù)后3天、7天、14天血壓水平、左室重量指數(shù)均顯著高于對照組(P0.01)，表明超壓力負(fù)荷肥厚心肌模型建成。給藥組3天、7天的血壓水平較手術(shù)組無顯著下降(P0.05)，14天時血壓水平較手術(shù)組顯著下降(P0.01)；而給藥組3天、7天、14天的左室重量指數(shù)較手術(shù)組顯著下降(P0.05,0.01)，見表1。二、心肌組織Ang水平和ACE活性變化手術(shù)組術(shù)后3天、7天、14天心肌組織Ang水平和ACE活性顯著高于對照組(P0.01)，給藥組7天、14天時心肌組織Ang水平和ACE活性顯著高于手術(shù)

14、組(P0.05,0.01)，見表2。血漿Ang水平各組間無顯著差異，僅14天時，給藥組的血漿Ang水平顯著高于對照組(P0.01)。表1術(shù)后頸動脈血壓、左室重量指數(shù)的變化(±s,n=8)項目血壓(kPa)左室重量指數(shù)(mg/g)對照組手術(shù)組給藥組對照組手術(shù)組給藥組3天13.8±1.5423.5±1.84*23.5±1.692.02±0.072.22±0.06*2.12±0.087天16.4±1.5628.0±1.63*27.5±1.681.89±0.082.68±0.09*2

15、.46±0.0714天16.4±1.4235.1±1.78*26.4±1.531.93±0.082.97±0.07*1.99±0.06注：與對照組比較：*P0.01；與手術(shù)組術(shù)后3天比較：P0.05;與手術(shù)組術(shù)后7天比較：P0.01；與手術(shù)組術(shù)后14天比較：P0.01 表2術(shù)后心肌組織Ang水平ACE活性的變化(±s,n=8)項目Ang水平(pg/g.wet mass)ACE活性(u/g.Wet mass)對照組手術(shù)組給藥組對照組手術(shù)組給藥組3天279±18.4307±19.0*316±

16、;18.753.8±11.376.4±11.8*87.3±14.37天281±17.7322±17.3*336±19.857.4±11.093.2±11.5*108.4±13.314天277±18.8356±13.9*388±14.557.7±12.1117.4±11.5*141.9±11.6注：與對照組比較：*P0.01；與手術(shù)組術(shù)后7天比較：P0.05;與手術(shù)組術(shù)后14天比較：P0.01 三、心肌組織TGF-1的表達(dá)變化手術(shù)組心肌細(xì)胞胞漿TG

17、F-1表達(dá)較對照組顯著增加(P0.01)，高峰在術(shù)后7天、14天時回到對照組水平；核表達(dá)術(shù)后顯著減少(P0.01)，14天時核表達(dá)陰性。給藥組的胞漿表達(dá)較手術(shù)組顯著下降(P0.01)，核表達(dá)較手術(shù)組顯著增加(P0.01)，核表達(dá)陽性率由對照組的23%增加到43%，見表3。表3術(shù)后心肌細(xì)胞TGF-1表達(dá)變化(±s,n=8)項目陽性信號指數(shù)核表達(dá)陽性計數(shù)(個/視野)對照組手術(shù)組給藥組對照組手術(shù)組給藥組3天33.29±2.4438.75±2.74*36.59±2.669.4±1.15.4±1.1*8.3±1.27天33.56

18、77;2.3955.75±3.02*44.63±2.678.8±1.44.0±1.2*12±1.214天33.96±2.5634.99±2.4634.16±2.149.5±1.20*17.5±1.2注：與對照組比較：*P0.05；*P0.01;與手術(shù)組術(shù)后3天比較：P0.01;與手術(shù)組術(shù)后7天比較：P0.01；與手術(shù)組術(shù)后14天比較：P0.01 四、心肌組織的病理改變手術(shù)組術(shù)后3天時心肌有點灶壞死，肌纖維斷裂及明顯的淋巴、單核細(xì)胞浸潤；術(shù)后7天時這些病變呈多灶性分布，肌纖維增粗，核增大，形態(tài)不規(guī)

19、則，核仁濃染；術(shù)后14天時有多灶肉芽腫形成，間質(zhì)增生。給藥組的上述病理改變明顯減輕。討論在本實驗中，我們應(yīng)用小劑量Losartan在無明顯降壓條件下，左室重量指數(shù)顯著下降，左室肥厚的病理改變明顯減輕，說明Losartan能有效抑制左室肥厚，也更進(jìn)一步證實左室肥厚與心肌局部的血管緊張素系統(tǒng)有關(guān)3。TGF-1是多功能調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化，參與胞外基質(zhì)的合成及降解，與心臟的生長、發(fā)育、修復(fù)有關(guān)4，5。本實驗結(jié)果表明，腹主動脈縮窄后，心肌局部的血管緊張素系統(tǒng)激活，TGF-1在心肌細(xì)胞胞漿的表達(dá)明顯增加，在胞核表達(dá)明顯減少，左室肥厚的病理改變明顯。應(yīng)用小劑量血管緊張素型受體拮抗劑Losartan在無明顯降壓條件下，TGF-1在胞漿的表達(dá)明顯減少，在胞核的表達(dá)明顯增加，左室肥厚被顯著抑制。TGF-1的這種表達(dá)變化說明其參與左室肥厚的發(fā)生、發(fā)展。在胞漿的表達(dá)可能促進(jìn)肥厚，在胞核的表達(dá)可能抑制肥厚，且血管緊張素可能通過其型受體調(diào)控TGF-1表達(dá)而致左室肥厚。唐兵（成都軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科610083）劉世玉（成都軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科610083）速曉華（成都軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科610083）肖東（成都軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科610083）褚桂珍（成都軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科610083）周興文（成都軍區(qū)總醫(yī)院 心內(nèi)科610083）參考文獻(xiàn)1，Kannel WB.Epi