臍血CD34+細胞和外周血單核細胞兩種來源的樹突狀細胞特性的比較研究

1、    臍血CD34+細胞和外周血單核細胞兩種來源的 樹突狀細胞特性的比較研究        【摘要】目的體外大量擴增和純化具有典型表型、形態(tài)和功能的樹突狀細胞（DC），以進行相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。方法采用免疫磁珠法分離臍血CD34+細胞及外周血去B、去T淋巴細胞的單個核細胞(單核細胞)，然后以GM-CSF、IL-4、TNF-、Flt3配基(FL)、SCF等不同的細胞因子配伍，分別誘生DC，通過流式細胞儀、電鏡、光鏡分析其特性，同時檢測其刺激同種T細胞增殖的能力。

2、結(jié)果臍血與外周血誘生DC的方案不同，由臍血CD34+細胞誘導(dǎo)DC時，GM-CSF+TNF-+SCF+FL組合可使CD1a+細胞比例增至（27.18±1.56）%，明顯高于單獨應(yīng)用GM-CSF組(0.65±0.38)%。外周血單核細胞誘導(dǎo)的DC，則GM-CSF+高劑量IL-4（1 000 U/ml）組合效率最高，誘生的CD1a+細胞可達（21.80±0.32）%。兩種來源的DC在表型及形態(tài)上差異無顯著性，兩者同樣具有刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力。結(jié)論從臍血和外周血均可誘生DC，根據(jù)應(yīng)用目的的不同對其進行選擇，這為DC用于臨床治療選擇不同細胞來源提供了實驗基礎(chǔ)?！娟P(guān)

3、鍵詞】樹突細胞造血細胞生長因子造血干細胞單核細胞 Studies on the properties of dendritic cells from cord blood CD34+ cells and peripheral blood monocytesWANG Xiao, PEI Xuetao, LI Liang, et al. Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing100850【Abstract】ObjectiveEx vivo expansion and purification of dendritic cells(DC) w

4、ith typical phenotype, morphology and function are critical to the further studies on DC and their clinical application. MethodsCD34+ cells were isolated from umbilical cord blood by using a high-gradient magnetic cell sorting system (MACS), and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were deplete

5、d of T and B cells by mixing them with T/CD2 and B/CD19 magnetic beads. DC were induced and expanded with different combinations of cytokines. They were identified for their properties by FACS, electronic microscopy, microscopy, and mixed lymphocyte reaction (MLR). Results Cultures of cord blood CD3

6、4+ cells with the combination of GM-CSF+TNF-+SCF+FL yielded （27.18±1.56）% CD1a+ cells,much higher than that (0.65±0.38)% with GM-CSF alone. The combination of GM-CSF and high dose IL-4(1 000 U/ml) was the most potential for expanding CD1a+ cells (21.8±0.32)% for PBMC. Both of the DC f

7、rom different sources were similar in phenotype and morphology, and had the capacity to stimulate proliferation of allogeneic T lymphocytes. Conclusion Both of cord blood and peripheral blood are the source for generation of a large number of typical DC, and can be adopted for the application accord

8、ing to different purposes. These results lay foundation for the immunotherapy with DC.【Key words】Dendritic cellsHematopoietic cell growth factorsHematopoietic stem cellsMonocytes樹突狀細胞（dendritic cell , DC）因其專職遞呈抗原、刺激體內(nèi)初始T細胞，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨特的地位1。DC在組織中含量甚微，其來源的困難限制了研究的深入。近年來有關(guān)DC誘生方案的探討已成為熱點，其中包括尋求DC合適的來源

9、、最佳的細胞因子配伍及應(yīng)用順序、完善的培養(yǎng)條件等。因前體細胞來源不同，采用的細胞因子也不盡相同2，3。目前，從DC典型的形態(tài)、膜表面表達的主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC)類分子、能移行至淋巴器官和刺激初始T細胞增殖活化，及其特異性表面標志等可確認DC4。誘生方案成熟后，可根據(jù)不同目的選擇不同細胞來源誘生DC，開展DC在腫瘤、感染、移植免疫、自身免疫等方面的研究，從而為實現(xiàn)DC的臨床應(yīng)用創(chuàng)造條件。材料和方法1材料MiniMACS磁性分離儀為德國Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品；Coulter免疫磁性分離儀Coulter Immunotech生產(chǎn)；流式細胞儀為美國FACScan BDIS產(chǎn)

10、品；鈷源為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；液閃計數(shù)儀為Beckman產(chǎn)品。臍血及外周血均采自解放軍總醫(yī)院。GM-CSF為Glaxo產(chǎn)品；IL-4為Promega產(chǎn)品；TNF-為Genzyme產(chǎn)品；SCF為Sandos產(chǎn)品；FL為Immunex產(chǎn)品。單克隆抗體(單抗)CD34 QBEND/10為Miltenyi Biotec產(chǎn)品；PE標記鼠抗人CD1a單抗、FITC標記鼠抗人CD80單抗和FITC標記鼠抗人HLA-DR單抗，購自深圳晶美生物工程有限公司；免疫磁珠吸附的CD2、CD19單抗為Coulter Immunotech產(chǎn)品；免疫磁珠吸附的DC單抗為Coulter Immunotech產(chǎn)品。2臍血CD3

11、4+細胞的分離純化采用MiniMACS免疫磁性分離系統(tǒng)進行5。臍血（CB）經(jīng)5g/L的甲基纖維素沉降，經(jīng)Ficoll（相對密度為1.077）梯度離心分離出單個核細胞（CBMNC），洗滌后標記抗體與磁珠（抗CD34抗體為QBEND/10，磁珠為羊抗鼠IgG1免疫磁珠，均為15稀釋）。標記細胞在通過置于磁場中的分離柱時，洗脫除去CD34-細胞，將分離柱移出磁場，加壓洗脫，收集組分為CD34+細胞。3外周血單核細胞的分離純化采用Coulter吸附單克隆抗體-磁珠陰性選擇系統(tǒng)。按上述方法從外周血中分離單個核細胞（PBMNC），以T、B淋巴細胞特異性CD2、CD19單抗-磁珠標記細胞，置于磁場中用以去除

12、T、B淋巴細胞，待細胞懸液的上清清亮后（約10分鐘），吸取上清，用緩沖液離心洗滌，收集到的細胞即為單核細胞。4樹突狀細胞的誘導(dǎo)臍血CD34+細胞與外周血單核細胞以5×103/ml接種于12孔板中，每孔1 ml。培養(yǎng)體系IMDM含體積分數(shù)為12.5%的HS和FCS、5×10-7mol/L氫化考的松以及不同組合的GM-CSF（40 ng/ml）、TNF-（50 U/ml）、SCF（100 ng/ml）、FL（40 ng/ml）和IL-4（400 U/ml、1 000 U/ml）。37 、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，每周半量換液。5流式細胞儀檢測細胞表型CD1a與HLA-D

13、R均采用直接標記法，將細胞分成不同組別，CD1a為PE熒光標記，CD80和HLA-DR為FITC熒光標記，抗體以110稀釋，4 孵育30分鐘，洗滌兩次，重新懸浮后用流式細胞儀檢測。6電鏡分析透射電鏡觀察：DC懸液離心，細胞沉淀用體積分數(shù)為4%的戊二醛和體積分數(shù)為1%的鋨酸固定，梯度乙醇脫水，經(jīng)超薄切片鉛鈾染色后，透射電鏡觀察并攝片。掃描電鏡觀察：DC懸液用PBS洗兩次，體積分數(shù)為4%的戊二醛固定后，PBS洗1次，制成懸液滴片，體積分數(shù)為1%的鋨酸固定，梯度乙醇脫水，掃描電鏡觀察并攝片。7DC刺激同種T細胞增殖反應(yīng)7.1分離純化T淋巴細胞： 采用Coulter CD2免疫磁珠陽性選擇系統(tǒng)分離T細

14、胞。人外周血單個核細胞1×107/ml 與100 l CD2磁珠混勻，作用10分鐘后置于磁場中，待上清清亮后，移棄上清，將細胞移出磁場，充分洗滌吸附于管壁上的細胞，此為陽性選擇的T細胞，用作同種T淋巴細胞增殖反應(yīng)。7.2DC刺激同種T細胞增殖反應(yīng)：DC與PBMC以每孔1×103，3×103，1×104接種于96孔板，每組3個復(fù)孔，經(jīng)60Co 射線照射滅活（3 000 cGy），然后每孔加入1×105 T淋巴細胞，共培養(yǎng)4天，于培養(yǎng)結(jié)束前16小時加入3H-TdR,18.5kBq/孔，反應(yīng)結(jié)束時收集細胞，液閃計數(shù)儀檢測放射性核素每分鐘閃爍計數(shù)值。8

15、統(tǒng)計學(xué)處理采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗。結(jié)果1細胞因子配伍對DC生成的影響臍血CD34+細胞為造血干/祖細胞，外周血單核細胞含有向DC分化的髓系前體細胞，二者在細胞因子作用下經(jīng)兩周的培養(yǎng)均可向DC定向誘導(dǎo)分化。臍血CD34+細胞單獨加入GM-CSF體外培養(yǎng)時，以生成單核細胞為主，CD1a+細胞僅占（0.65±0.38）%，而不同的細胞因子組合可使CD1a+細胞的比例增至（4.12±0.60）% （27.18±1.56）%（組間比較，P<0.01）。結(jié)果表明，不同細胞因子配伍對DC的誘導(dǎo)效率顯示出差異，TNF-（50 U/ml）為臍血CD34+細胞定向誘導(dǎo)DC所

16、必需，它可加速DC的成熟；在GM-CSF+TNF-的組合中加入SCF或FL，對臍血DC的誘生有明顯的協(xié)同作用，CD1a+細胞的比例分別增加至（12.3±0.33）%和（18.0±0.11）%，F(xiàn)L的作用更為明顯。IL-4的量對DC的誘生效率有很大影響，400 U/ml以下誘生的細胞，CD1a+細胞僅占（3.30±0.16）%，大多數(shù)細胞在形態(tài)上更趨向巨噬細胞而不是DC，當IL-4加至1 000 U/ml時，CD1a+細胞為（21.8±0.32）%(組間比較，P<0.01)。2DC的形態(tài)與表型在GM-CSF、TNF-、FL、SCF的組合中，臍血CD3

17、4細胞誘生的DC量最高，表型檢測CD1a+細胞占（27.18±1.56）%,CD80+細胞的比例為（42.28±3.16）%，HLA-DR表達占（93.7±1.0）%。培養(yǎng)至第8天，光鏡下觀察，細胞不貼壁，胞膜向外延伸出尖刺狀突起。透射電鏡下觀察，DC的幔狀突起更加清晰，胞漿內(nèi)有大量線粒體聚集，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，溶酶體及吞噬體不多。掃描電鏡示DC的粗糙表面和層疊狀的皺襞。外周血的單核細胞在GM-CSF、IL-4誘生1周后即出現(xiàn)DC，較CD34+細胞來源DC體積小，電鏡特點與前述差異不明顯。兩種來源的DC均在第8天時以流式細胞儀（FACS）分析其表型，結(jié)果顯示了細胞因子組

18、合、濃度與其表達量的關(guān)系：外周血單核細胞在IL-4為400 U/ml時，產(chǎn)生的主要是巨噬細胞。CD1a+細胞占（3.3±0.16）%，當IL-4用量達8001 000 U/ml時，DC才較多，CD1a+、CD80+和HLA-DR+細胞的比例分別為（21.8±0.32）%、（50.2±3.12）%和（94.6±1.58）%。3DC的免疫刺激活性DC刺激T細胞增殖反應(yīng)時，當刺激細胞(外周血單核細胞-DC或臍血CD34細胞-DC)與T細胞的比例為110時，細胞3H-TdR摻入量分別為（60.80±1.26）×103/min和（48.20&#

19、177;1.41）×103/min，兩組比較差異無顯著性;但兩組分別與對照組（7.20±1.16）×103/min和（9.00±0.97）×103/min比較，P值均<0.01，差異有顯著性，說明臍血CD34+細胞與外周血單核細胞誘生的DC均能激發(fā)同種異體T細胞的增殖，有較強的抗原遞呈能力。討論細胞因子配伍及應(yīng)用順序在不同細胞來源DC的誘生中作用不同。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，臍血CD34+細胞作為DC的一種來源，其細胞因子組合中除需要GM-CSF和TNF-的支持外，SCF和FL也是有明確擴增協(xié)同效應(yīng)的兩種因子，SCF、FL存在的實驗組中，其CD

20、1a+細胞比例由GM-CSF+TNF-組的（4.12±0.6）%分別增至（12.3±0.33）%和（18.0±0.11）%（組間比較，P<0.01）。目前，認為FL的作用與CD34+細胞表達高水平的Flt3有關(guān)，兩者結(jié)合可促進細胞的增殖。另外，F(xiàn)L可提高DC前體細胞的數(shù)量并延長其存活時間。由外周血的單核細胞誘生的DC，其產(chǎn)生量與表型的表達明顯依賴于IL-4的加入量，且細胞形態(tài)也由巨噬細胞為主轉(zhuǎn)向DC為主，這說明IL-4在早期加入可抑制單核細胞向巨噬細胞的分化。在功能檢測中，外周血單核細胞與臍血CD34+細胞誘生的DC與T細胞的比例為110時，兩種來源的DC差異無顯著性，都有刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力，能發(fā)揮較強的抗原遞呈能力，均可作為誘生DC的理想來源。目前有學(xué)者認為，DC功能的發(fā)揮更多的是在病變部位或病原體與DC接觸的微環(huán)境中，因此對這些DC進行深入探討可能更有實際意義。本課題受國家杰出青年科學(xué)基金（39825111）資助作者單位：100850北京