鏈球菌抗原刺激的銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF－α和IL－6的檢測

1、    鏈球菌抗原刺激的銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF和IL6的檢測        以往的研究表明1,銀屑病患者外周血單一核細(xì)胞(PBMC)對鏈球菌抗原刺激反應(yīng)明顯;而且,鏈球菌抗原刺激PBMC的培養(yǎng)上清液可促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞間粘附因子1(ICMA1)、HLADR分子表達(dá)。說明培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子發(fā)生了質(zhì)或量的變化。為此，我們進(jìn)一步檢測了銀屑病患者鏈球菌抗原刺激的PBMC培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子（TNF）和白介素6（IL6）變化。期望有助于探討

2、銀屑病的發(fā)病機(jī)制。 表1銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清液中TNF和IL6的檢測結(jié)果組別例數(shù)TNF活性(細(xì)胞死亡)IL6活性(A值)鏈球菌刺激PHA刺激PHA刺激鏈球菌刺激對照組817.57±5.8528.66±18.390.686±0.2020.436±0.038銀屑病組1211.47±5.7822.37±14.160.766±0.2120.645±0.110注：鏈球菌刺激的PBMC培養(yǎng)上清液，PHA刺激的PBMC培養(yǎng)上清液，與對照組比較，P<0.05一、材料和方法（一）臨床資料：臨床和病理確診的點(diǎn)滴狀銀屑病患者

3、7例、斑塊狀5例；健康對照8例。點(diǎn)滴狀病例多為初發(fā),其中6例有上呼吸道感染病史；年齡1739歲；病程1周至2年。斑塊狀患者年齡1757歲；病程6個月至20年；所有患者至少1個月內(nèi)未接受皮質(zhì)類固醇及其他免疫抑制劑治療。（二）方法：1.細(xì)胞:鼠纖維肉瘤細(xì)胞株WEHI164、IL6依賴細(xì)胞株7TD1,來自北京大學(xué)臨床免疫室。2細(xì)菌:溶血型鏈球菌菌株,北京大學(xué)微生物教研室提供。3溶血型鏈球菌的培養(yǎng)、收獲及定量:見文獻(xiàn)1。4各組PBMC24h培養(yǎng)上清液的收獲及貯存見文獻(xiàn)1。5結(jié)晶紫比色法檢測PBMC培養(yǎng)上清液中TNF改變2:生長良好的WEHI164細(xì)胞,用PRMI1640配成5×105/mL細(xì)

4、胞懸液。每孔100L加入96孔板;分銀屑病和對照組加入PHA和鏈球菌刺激的PBMC培養(yǎng)上清液,每孔100L;37,體積分?jǐn)?shù)5CO2條件下24h;棄上清液,PBS洗1次;每孔加入0.5結(jié)晶紫200L,30min;棄結(jié)晶紫,用蒸餾水洗68次;每孔加入冰醋酸水溶液120L振蕩3min,測波長570nm處A值。TNF活性以細(xì)胞死亡百分比表示。細(xì)胞死亡百分比=1(實(shí)驗(yàn)組A空白組A)/(對照組A空白組A)×100,其中對照組為未加PBMC培養(yǎng)上清液者。6MTT法檢測PBMC培養(yǎng)上清液中IL6改變2:7TD1細(xì)胞配成1×105/mL細(xì)胞懸液;每孔100L加入96孔板;同時加入各組PBMC

5、培養(yǎng)上清液,每孔20L;再加入PRMI1640培養(yǎng)基80L/孔;37,體積分?jǐn)?shù)5CO2條件下48h;培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入MTT50L(5mg/mL);繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心棄上清液;加入鹽酸異丙醇(1300)120L/孔,測波長570nm處A值。以各組A值比較PBMC培養(yǎng)上清液中IL6活性。（三）統(tǒng)計學(xué)處理:用SPSS軟件作組間t檢驗(yàn)。二、結(jié)果鏈球菌抗原刺激的銀屑病患者PBMC培養(yǎng)上清液中TNF水平下降(與健康對照比較，P<0.05)、IL6水平升高(與對照組比較，P<0.05);而PHA刺激的PBMC培養(yǎng)上清液中各組TNF和IL6水平兩組比較差異無顯著性。見表1。三、討論TNF主

6、要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,活化的角質(zhì)形成細(xì)胞也可以產(chǎn)生3。由于許多實(shí)驗(yàn)證明TNF體外可以明顯抑制表皮細(xì)胞增殖4,所以銀屑病患者PBMC的鏈球菌抗原刺激培養(yǎng)上清液中TNF活性降低可能對疾病的發(fā)展有意義。銀屑病患者在一定條件下,不能有效足量地產(chǎn)生抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的TNF,可能是銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的原因之一。至于出現(xiàn)TNF活性下降的原因,除遺傳因素導(dǎo)致PBMC功能缺陷之外,有可能鏈球菌抗原或超抗原只作用于T淋巴細(xì)胞，而對單核/巨噬細(xì)胞少有影響。本實(shí)驗(yàn)的另一個發(fā)現(xiàn)是鏈球菌抗原刺激的銀屑病PBMC培養(yǎng)上清液中IL6水平升高,從一個側(cè)面證實(shí)了銀屑病患者鏈球菌反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的存在,有可能受鏈球菌

7、抗原刺激活化的T淋巴細(xì)胞是IL6的主要來源。作者單位：張理濤（110001沈陽,中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院皮膚科）高興華（110001沈陽,中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院皮膚科）陳洪鐸（110001沈陽,中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院皮膚科）呂克己（北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科）陳學(xué)榮（北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科）殷金珠（臨床免疫室）參考文獻(xiàn)1張理濤，陳學(xué)榮，殷金珠.溶血型鏈球菌誘發(fā)點(diǎn)滴型銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究.中華皮膚科雜志，1999，32:99100.2錢玉昆,殷金珠.實(shí)用免疫學(xué)新技術(shù).第1版.北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1994.5355.3 Kock A, Schwarz T, Kirnba

8、uer R,et al. Human keratinocytes are a source for tumor necrosis factor alpha: Evidence for synthesis and release upon stimulation with endotoxin or ultraviolet light. J Exp Med， 1990， 172:1609 1614. 4 Kono T, Tanii T, Furukawa M, et al. Effect of human recombinant tumor necrosis alpha(TNF alpha) on