微生物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)二：細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定

1、目的：測(cè)量細(xì)菌在液體批次培養(yǎng)(batch culture)中的生長(zhǎng)，繪製生長(zhǎng)曲線圖並計(jì)算生長(zhǎng)速率。原理：測(cè)量細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度，必須先測(cè)出細(xì)菌族群在培養(yǎng)期間不同時(shí)間點(diǎn)的密度或數(shù)量，再繪圖或以電腦軟體求出族群增長(zhǎng)的速率。而測(cè)量族群密度常用的方法有三：(1)直接計(jì)數(shù)法 在顯微鏡下算出固定體積培養(yǎng)液內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目，由於細(xì)菌細(xì)胞太小，容易與溶液中的灰塵混淆，此方法大多用於酵母菌、單細(xì)胞藻類等較大型的真核微生物；(2)混濁度 利用分光光度計(jì)以波長(zhǎng)590 - 600 nm的可見(jiàn)光測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)液的混濁度，通常以O(shè)D590表示，其數(shù)值在0.9以下時(shí)與細(xì)菌細(xì)胞密度呈直線關(guān)係，讀取數(shù)值超過(guò)0.9時(shí)則先做1

2、0倍稀釋再測(cè)量混濁度，獲得的細(xì)菌密度乘以10即得到原本的密度；(3)平盤測(cè)定法 將細(xì)菌培養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋後取一定體積塗在平盤培養(yǎng)基上，培養(yǎng)後計(jì)算培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目以推算出原本的細(xì)胞密度。第三個(gè)方法將在下一次實(shí)驗(yàn)中操作，本次實(shí)驗(yàn)使用第二個(gè)方法，為最便利快速而常用的細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)量法。材料：(每組)i. 含5 ml LB (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%)培養(yǎng)基的白色旋蓋試管 6ii. 含5 ml 以NH4+為氮源的葡萄糖低限培養(yǎng)基(glucose minimalmedium) (glucose 2%, Na2HPO4 1.3%, KH2PO4

3、 0.3%, NaCl 0.05%,NH4Cl 0.1%)的白色旋蓋試管 3iii. 含5 ml 以NO3- 為氮源的葡萄糖低限培養(yǎng)基(glucose minimalmedium) (glucose 2%, Na2HPO4 1.3%, KH2PO4 0.3%, NaCl 0.05%,KNO3 0.19%)的白色旋蓋試管 3iv. 過(guò)夜大腸桿菌培養(yǎng)液(培養(yǎng)在以NH4Cl為氮源的葡萄糖低限培養(yǎng)基中) 1v. 無(wú)菌水 100 ml 1vi. 空懸蓋試管4支vii. P1000微量吸管一支、1000 ml微量吸管尖盒、標(biāo)籤紙8個(gè)、透明膠帶、小燒杯一個(gè)全班：分光光度計(jì)步驟：1. 在裝有LB培養(yǎng)液的四支試

4、管蓋上貼上標(biāo)籤，註明組別，並分別標(biāo)示為A、B、C與D。2. 將分光光度計(jì)電源打開(kāi)並暖機(jī)10分鐘。依照使用說(shuō)明將光度計(jì)歸零，將波長(zhǎng)定為590 nm。3. 以微量吸管吸取100 l細(xì)菌培養(yǎng)液，加入四支試管中。4. 將含有新鮮培養(yǎng)液的試管插入分光光度計(jì)中歸零之後，將已接種細(xì)菌的試管插入，加蓋後讀出培養(yǎng)液的OD值並作紀(jì)錄，OD值若未達(dá)0.1可再多加一點(diǎn)菌液，但每一支試管應(yīng)加入相同體積菌液。5. 將A、B兩支試管管蓋轉(zhuǎn)鬆，以膠帶固定以防脫落，C、D試管的管蓋旋緊後，插在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上對(duì)稱的位置，將培養(yǎng)器電源打開(kāi)，轉(zhuǎn)速設(shè)在約150 rpm，在室溫進(jìn)行培養(yǎng)。6. 在兩支以NH4Cl為氮源的葡萄糖低限培養(yǎng)基試管

5、上貼上標(biāo)籤，註明組別並標(biāo)示為E和F，在兩支以KNO3為氮源的葡萄糖低限培養(yǎng)基試管上貼上標(biāo)籤，註明組別並標(biāo)示為G和H。7. 如步驟3和4的描述將細(xì)菌接種到E、F、G、H試管內(nèi)，並紀(jì)錄初始的OD值。8. 將四支試管管蓋轉(zhuǎn)鬆，以膠帶固定以防脫落，插在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上置，將培養(yǎng)器電源打開(kāi)，轉(zhuǎn)速設(shè)在約150 rpm，在室溫進(jìn)行培養(yǎng)。9. 每隔約20-30分鐘取下試管，依步驟4讀取各試管培養(yǎng)液OD值並確實(shí)紀(jì)錄讀取數(shù)值及讀取時(shí)間。操作時(shí)不要讓旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器暫停時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，取下試管後立刻再開(kāi)啟培養(yǎng)器電源，以免影響旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器上其他試管內(nèi)的生長(zhǎng)速率。測(cè)量後立刻將試管放回培養(yǎng)器上繼續(xù)培養(yǎng)。10. 將所紀(jì)錄的時(shí)間與OD值作圖，

6、以時(shí)間為橫軸，log(OD590)為縱軸，菌液進(jìn)入log phase後的各點(diǎn)應(yīng)落在一直線上，連續(xù)測(cè)量至三個(gè)(含)以上的測(cè)量值成一直線，利用此直線找出細(xì)菌生長(zhǎng)的加倍時(shí)間(doubling time)與平均生長(zhǎng)速率(mean growth rate constant)。11. OD590超過(guò)0.9以上時(shí)細(xì)胞密度與log(OD590)值不再成直線關(guān)係，因此須先以微量吸管吸取培養(yǎng)液0.5 ml，加4.5 ml培養(yǎng)液稀釋10倍，取得OD值後再乘以10以求得正確的混濁度。結(jié)果與討論將數(shù)值畫在下圖中，並利用位於log phase的各點(diǎn)作出最適直線(best-fit lines)。利用MS Excel等軟體求出各試管中細(xì)菌在log phase的生長(zhǎng)速度()或利用上圖求出各試管中細(xì)菌在log phase的加倍時(shí)間(g)，再由g推算出1. 在LB培養(yǎng)基的兩組實(shí)驗(yàn)(A、B與C、D)中，哪