復(fù)方鱉甲軟肝片抑制大鼠酒精性肝纖維化作用機(jī)制研究

1、復(fù)方鱉甲軟肝片抑制大鼠酒精性肝纖維化作用機(jī)制研究                   作者：李豐衣,孫勁暉,田德祿,祝世功,潘慧,劉霞,王慶寶   【摘要】  目的 探討復(fù)方鱉甲軟肝片對實(shí)驗(yàn)性大鼠酒精性肝纖維化的抑制作用及機(jī)制。方法 40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥(復(fù)方鱉甲軟肝片)治療組和西藥(安琺特)治療組,以“酒精-吡唑-玉米油”混合液灌胃并飼以高脂飲食16周

2、制備大鼠酒精性肝纖維化模型,給藥4周后檢測肝纖維化指標(biāo)、肝組織病理學(xué)及肝組織中轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 酒精性肝纖維化模型大鼠肝功能顯著異常,肝纖維化明顯；經(jīng)4周治療,與模型組比較,中藥組及西藥組血清中透明質(zhì)酸(HA)含量顯著下降(P0.01),且中藥組能顯著下調(diào)大鼠肝組織中TGF-1蛋白含量。結(jié)論 復(fù)方鱉甲軟肝片能夠有效阻止和逆轉(zhuǎn)酒精性肝纖維化的進(jìn)程。 【關(guān)鍵詞】  復(fù)方鱉甲軟肝片；酒精性肝纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子-1；大鼠     Abstract：Objective To probe into the inhibiting ac

3、tion of Compound Biejiarangan Troche on alcohol hepatic fibrosis in rats. Methods Forty Wistar male rats were divided into control, model, Compound Biejiarangan Troche and Anfate treatment groups. Alcohol hepatic fibrosis model was established by intragastrical perfusion with mixture of “alcohol-Pyr

4、azole-coil oil” and high-fat diet for sixteen weeks. After four weeks intervention, changes of hepatic fibrosis index, liver tissue pathology and expression of TGF-1 in liver tissue were observed. Results The hepatic function of model rats were changed and abnormal, with obvious fibrosis in hepatic

5、histopathology. After intervention for four weeks, HA decreased (P0.01) in serum of Compound Biejiarangan Troche group and Anfate group compared with that of model group, and expression of TGF-1 decreased in Compound Biejiarangan Troche group compared with Anfate group. Conclusion Compound Biejiaran

6、gan Troche has effect of inhibiting and reversing alcohol hepatic fibrosis in rats.    Key words：Compound Biejiaruangan Troche；alcohol hepatic fibrosis；TGF-1；rat     本實(shí)驗(yàn)采用“白酒-吡唑-玉米油”混合液灌胃法復(fù)制動物模型,觀察復(fù)方鱉甲軟肝片的抗纖維化作用,并探討其對轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)的影響及抗酒精性肝纖維化作用機(jī)制。  

7、0; 1  實(shí)驗(yàn)材料 1.1  動物     清潔級雄性Wistar大鼠40只,體重(200±10)g,購于北京維通利華公司,許可證號：SCXK20042005。 1.2  主要藥物及試劑     復(fù)方鱉甲軟肝片由鱉甲、赤芍、冬蟲夏草、三七、紫河車、連翹、當(dāng)歸、莪術(shù)、黨參、黃芪和板藍(lán)根組成,內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn),批號20020501,用前以生理鹽水溶解；安琺特,黑龍江衛(wèi)世醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字：H23023289。透明質(zhì)酸(HA)、型膠原(C)及層粘連蛋白(LN)放

8、免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。TGF-1兔抗多克隆抗體(Santa Cruz),辣根酶標(biāo)記的羊抗兔二抗,DAB顯色系統(tǒng),均購自北京中山生物技術(shù)公司。 2  實(shí)驗(yàn)方法 2.1  分組及造模     將大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、中藥組和西藥組,每組10只。模型組、中藥組、西藥組采用“白酒-吡唑-植物油”混合液灌胃法復(fù)制動物模型1,每只大鼠灌胃白酒4.8 g/(kg?d)、吡唑24 mg/(kg?d)、玉米油2 mL/(kg?d)的混合液,灌胃16周。在灌胃白酒混合物的同時飼喂高脂飼料(基礎(chǔ)飼料-膽固醇-豬大油79120)。正常組每日用生理鹽

9、水灌胃,普通飼料喂養(yǎng)。 2.2  給藥     中藥組灌胃鱉甲軟肝片,給藥量0.54 g/(kg?d),西藥組灌胃安琺特,給藥量21.6 mg/(kg?d),2組均相當(dāng)于人臨床用量的5.4倍,均治療4周。正常組及模型組每日灌胃2 mL生理鹽水。 2.3  觀測指標(biāo)     造模16周后,正常組和模型組大鼠尾靜脈采血,分離血清,用放免分析法測定血清中HA、LN及C含量。治療4周后,正常組、模型組、中藥組和西藥組大鼠尾靜脈采血,分離血清,測定血清中HA、LN及C含量。治療4周后,取各組大鼠肝組織,常規(guī)石蠟包埋、切片、H

10、E染色、光鏡觀察,TGF-1免疫組化染色實(shí)驗(yàn)也采用該套石蠟塊。 3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法     應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用x±s表示,2組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析,各組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。4  結(jié)果 4.1  用藥前后大鼠血清中透明質(zhì)酸、IV型膠原及層粘連蛋白檢測結(jié)果 (見表1、表2)表1  用藥前2組大鼠血清中HA、LN和C含量比較(略)注：與正常組比較,*P0.05表2  用藥后各組大鼠血清中HA、LN和CIV含量比較(略)注：與正常組比較,*P0.01；與模型

11、組比較,P0.01    4.2  大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長因子-1蛋白表達(dá)免疫組化染色結(jié)果     本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測了正常組、模型組、中藥組及西藥組大鼠肝組織中TGF-1蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,正常組大鼠肝組織中TGF-1蛋白僅有少數(shù)散在肝細(xì)胞陽性表達(dá)；模型組大鼠肝組織中TGF-1蛋白肝細(xì)胞彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)；中藥組大鼠肝組織中TGF-1蛋白部分肝細(xì)胞陽性表達(dá)；西藥組中央靜脈周圍及肝小葉內(nèi)較多肝細(xì)胞陽性表達(dá)。大鼠TGF-1肝組織免疫組化染色結(jié)果初步顯示,復(fù)方鱉甲軟肝片和安琺特均能顯著下調(diào)大鼠肝組織中TG

12、F-1蛋白含量,且復(fù)方鱉甲軟肝片優(yōu)于安琺特。結(jié)果見圖1。 4.3  大鼠肝組織石蠟切片Mallory染色光鏡觀察結(jié)果     肝組織中的膠原經(jīng)Mallory染色,光鏡下呈藍(lán)色。正常組大鼠肝組織中僅有少量膠原表達(dá),肝細(xì)胞及匯管區(qū)、中央靜脈及竇周圍幾乎不見膠原纖維；模型組大鼠肝組織內(nèi)膠原水平顯著提高,中央靜脈及匯管區(qū)輕度纖維化；中藥組及西藥組大鼠肝血竇周圍膠原明顯減少,相鄰血竇間的纖維聯(lián)絡(luò)基本消失。Mallory染色初步表明,復(fù)方鱉甲軟肝片在降低肝組織膠原含量上療效接近安琺特。 5  討論     目前,肝纖維化的血清

13、標(biāo)志物主要有HA、LN、C。HA是一種廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的高分子多糖,肝纖維化時肝星狀細(xì)胞(HSC)合成HA增加,而肝內(nèi)皮細(xì)胞對HA降解能力下降,導(dǎo)致血清中HA水平明顯增高,其增高程度與肝組織炎癥和纖維化程度呈正相關(guān),可作為抗肝纖維化藥物治療動態(tài)觀察指標(biāo)。LN是一種糖蛋白,主要存在于基底膜,反映基底膜的更新率。LN在肝組織中含量甚微,當(dāng)肝竇毛細(xì)血管化和匯管區(qū)纖維化時,星狀細(xì)胞大量分泌LN和C,隨著肝纖維化進(jìn)展而合成增加,血清中LN明顯增高。C在肝內(nèi)合成和代謝,在肝纖維化發(fā)展過程中,肝組織CIV過量合成,出現(xiàn)肝竇毛細(xì)血管化,使血液中C異常增加,可能是最早增生的纖維,C被認(rèn)為是反映膠

14、原蛋白生成出現(xiàn)最早的重要指標(biāo)。LN及C是血管膽管基底膜骨架的主要膠原成分,肝竇內(nèi)無明顯沉著2-3。     近年來研究發(fā)現(xiàn),在眾多細(xì)胞因子中,TGF-1是最為重要的致纖維化因子。TGF-1對肝纖維化發(fā)生具有特別重要的病理生理學(xué)意義。TGF-1產(chǎn)生時均以非活性狀態(tài)存在,與相應(yīng)受體無結(jié)合活性。肝受損時,肝內(nèi)的炎細(xì)胞、星狀細(xì)胞(HSC)、枯否細(xì)胞等自分泌或旁分泌非活性TGF-1 ,非活性TGF-1被炎癥環(huán)境中的各種酶和細(xì)胞因子激活,刺激上述細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生TGF-1,形成逐級放大效應(yīng),導(dǎo)致TGF-1大量生成和激活。TGF-1在肝纖維化中的作用具體表現(xiàn)在：TGF-1啟動和維

15、持肝HSC的活化,促進(jìn)其增殖；促進(jìn)HSC等細(xì)胞合成ECM；抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的產(chǎn)生,促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)的產(chǎn)生,以阻礙膠原的降解4-6。        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠肝臟組織HA、TGF-1蛋白表達(dá)和C表達(dá)顯著增強(qiáng),提示HA和TGF-1參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,進(jìn)一步證實(shí)TGF-1在肝纖維化過程中起重要作用；中藥組的肝纖維化程度較模型組減輕,肝組織HA、TGF-1蛋白表達(dá)和C表達(dá)亦顯著減弱,提示抑制纖維化肝組織HA、TGF-1蛋白表達(dá)可能是復(fù)方鱉甲軟肝片的抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)之一。復(fù)方鱉甲軟肝片可能通過下調(diào)TGF-1表達(dá),抑制膠原的合成和降解,從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)纖維化的目的。 【參考文獻(xiàn)】  1 李 健,牛建昭,曾 艷,等.復(fù)方鱉甲軟肝片對酒精性肝纖維化狄氏間隙膠原沉積的影響J.解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2004,29(7)：567570.2 李 琴,王寶恩,叢玉隆,等.凝血指標(biāo)在判斷肝硬化患者病變嚴(yán)重程度中的價(jià)值J.中華內(nèi)科雜志,2005,44(3)：188190.3 馮新利,徐貴平,歐陽艷.肝纖維化血清診斷方法研究進(jìn)展J.放射免疫學(xué)雜志,2003,16(2)：111117.4 吳 強(qiáng),宋少剛,楊 楓,等.大鼠肝纖維化中PD