固相微萃取-氣質(zhì)法測(cè)定土壤揮發(fā)性抑菌物質(zhì)

1、固相微萃取氣質(zhì)法測(cè)定土壤揮發(fā)性抑菌物質(zhì)許傳坤 莫明和 張克勤 *（云南大學(xué)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，昆明 650091）摘 要： 運(yùn)用固相微萃取氣相色譜/質(zhì)譜法（SPMEGC/MS），測(cè)定了參與土壤抑真菌作用的土壤揮發(fā)性成分和土壤細(xì)菌揮發(fā)性代謝物。通過比較土壤來源和土壤細(xì)菌來源的揮發(fā)性抑菌成分，發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)揮發(fā)性抑菌土壤和土壤細(xì)菌代謝物中普遍存在著三甲胺、二甲基二硫醚、3-甲基-2-戊酮、甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、N,N-二甲基辛胺、十九烷等化合物。這些化合物很有可能就是參與土壤抑菌作用，特別是揮發(fā)性物質(zhì)抑菌作用的主要成分。另外，本研究為深入了解土壤中參與抑菌作用的揮發(fā)性化合物

2、提供了簡(jiǎn)便有效的方法。關(guān)鍵詞：固相微萃取，土壤抑真菌作用，氣相色譜，質(zhì)譜，揮發(fā)性抑真菌物質(zhì)中圖分類號(hào)：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0253-2654（2004）0-00-0IDENTIFICATION OF VOLATILE FUNGISTATIC COMPOUNDS BY SPME-GC/MSXU Chuan-Kun，MO Ming-He，ZHANG Ke-QinUniversity, Kunming 650091)Abstract: The composition of volatile compounds of soils and that of soil bacterialme

3、tabolites were identified by using the SPME-GC/MS method. Results showed that some compounds, trimethylamine, 3-methyl-2-pentanoe, dimethyl disulfide, methyl pyrazine, 2,5-dimethyl-pyrazine, benzaldehyde, N,N-dimethyloctylamine and nonadecane, subsisted commonly in soils and soil bacterial metabolit

4、es with strong fungistatic activity. These compounds may be the key antifungal factors in soil fungistasis, especially soil volatilefungistasis. Otherwise, the method used in this study was a good tool for further study of soil volatile fungistasis.Key words：SPME, soil fungistasis, GC/MS, volatile f

5、ungistatic compound通常，真菌的繁殖體由于土壤抑真菌作用（soil fungistasis）的影響，不能正常萌發(fā)。自從Dobbs & Hinson于1953年首次報(bào)道“土壤抑真菌作用”這一現(xiàn)象以來，在隨后的近50年里，這一現(xiàn)象便成為了微生物土壤生態(tài)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一。針對(duì)植物病蟲草害開發(fā)的生物防治劑往往由于土壤抑菌作用導(dǎo)致生防菌菌孢子不能正常*基金項(xiàng)目：科技部攻關(guān)項(xiàng)目（No. 2002BA901A21），云南省應(yīng)基重點(diǎn)項(xiàng)目（No. 2000C0012Z） *聯(lián)系人 電話，Email: kqzhang1收稿日期：2003-10-08，修回

6、日期：2003-12-031 12* * (Key Laboratory of Conservation and Utilization for Bioresource, Yunnan萌發(fā)而防效大為降低。故這一作用的機(jī)理也成為了生防研究的重點(diǎn)之一。影響土壤抑菌作用的許多因素，如土壤理化條件、環(huán)境條件、真菌對(duì)土壤抑菌作用的敏感性、土壤中微生物群落組成等，得到了廣泛深入的研究14。許多研究認(rèn)為土壤中存在抑制繁殖體1,57萌發(fā)的抑制因子，特別是揮發(fā)性物質(zhì)，能夠強(qiáng)烈地抑制真菌孢子的萌發(fā)。氨氣、乙烯、烯丙醇等小分子化合物被證實(shí)在土壤抑菌過程中發(fā)揮著極其重要的作用。但是，由于它們極強(qiáng)的揮發(fā)性和極低的濃度，

7、這些小分子化合物在研究中很難被檢測(cè)。固相微萃取技術(shù)（SPME）是近年來發(fā)展起來一種無需溶劑，集萃取、濃縮和進(jìn)樣為一體的樣品前處理技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于食品、香料、藥品、尿樣、環(huán)境污染物、水體等痕量物質(zhì)的檢測(cè)。利用SPME纖維頭薄膜對(duì)化合物的吸附、富集，再與氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用，最高可達(dá)10的檢測(cè)級(jí)別。本文利用頂空固相微萃取氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法，對(duì)產(chǎn)生強(qiáng)抑真菌作用的土壤揮發(fā)性氣體和土壤微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析。通過比較其共同性，試圖了解抑菌性土壤揮發(fā)成分的構(gòu)成和產(chǎn)生來源，并且為揮發(fā)性土壤抑菌物質(zhì)的跟蹤、檢測(cè)鑒定建立一個(gè)簡(jiǎn)便高效的方法。1 材料與方法1.1 樣品從云南不同地區(qū)采集的，經(jīng)測(cè)定對(duì)真

8、菌具有廣泛抑制作用的土壤（土壤對(duì)真菌孢子萌發(fā)的平均抑制率達(dá)到70以上）：X27、X55、X30、X67。從土壤中分離的可產(chǎn)生強(qiáng)抑制真菌孢子萌發(fā)氣體的細(xì)菌菌株：S2715、S5502、S3010、S6703、S7406。1.2 儀器HP6890氣相色譜/5973質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Agilent Technologies, USA)。SPME手柄、SPME樣品萃取標(biāo)準(zhǔn)操作臺(tái)（Supelco, USA）、15mL頂空樣品瓶。SPME萃取頭：100m PDMS纖維頭、75m CAR/PDMS纖維頭、65m PDMS/DVB纖維頭、65m CW/DVB纖維頭（Supelco, USA）。1.3 樣品前處理土

9、樣：準(zhǔn)確稱取2.0g新鮮土樣于15.0mL頂空樣品瓶中，加0.2mL無菌水，加蓋密封，室溫下平衡5d。 細(xì)菌：接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中37搖瓶培養(yǎng)24h后，取2.0mL發(fā)酵液于15.0mL頂空瓶中,加蓋密封，4冰箱保藏。1.4 分析步驟將頂空瓶置于樣品萃取臺(tái)上，將SPME的針頭穿透樣品瓶膠塞，壓下活塞使纖維頭伸出不銹鋼套管后暴露于樣品上層空氣中。固體土樣，室溫下吸附10h；細(xì)菌發(fā)酵液用磁力攪拌子中速攪拌，加熱，吸附，萃取10min。然后迅速將纖維頭縮回并拔出針頭，立即插入氣相色譜的氣化室，推出纖維，利用氣化室高溫?zé)峤馕瞿繕?biāo)待測(cè)物1min2min。1.5 GC/MS條件2 -998HP-5

10、MS石英毛細(xì)管柱；載氣為He，流速1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度250；爐溫：起始50，保持2min，以8/min升溫至180，再以10/min升溫至240，保持5min；分流進(jìn)樣，分流比30：1；GC/MS接口溫度280；質(zhì)譜掃描范圍35550u;離子源：EI源；電子能量：70EV；譜圖檢索：采用Wiley27.3和Nist98譜庫(kù)進(jìn)行檢索。2 結(jié)果與討論 2.1 萃取頭選擇萃取頭的選擇是SPME的核心問題。非極性100m PDMS纖維頭對(duì)非極性、弱極性或親脂性組分靈敏度較高；弱極性的65m PDMS/DVB纖維頭對(duì)極性和非極性組分都有較好的吸附能力；65m CW/DVB纖維頭對(duì)極性，特別是

11、水溶性較好的化合物有較高靈敏度；而75m CAR/PDMS纖維頭對(duì)于揮發(fā)性較強(qiáng)的，如氣體硫化物有很好的吸附性。9我們分別用這四種萃取頭，對(duì)空白牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行了SPME-GC/MS測(cè)定。結(jié)果顯示，在空白牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，主要存在苯甲醛、苯乙醛、辛醛、環(huán)辛烷、壬醛、癸醛、十八醛、2-十一烯醛、十六醇、十七醇、二十五烷等化合物。通過比較出峰數(shù)和物質(zhì)檢出情況（表1），發(fā)現(xiàn)75m CAR/PDMS纖維頭較其它3種萃取頭，萃取范圍寬，可檢出化合物數(shù)多，對(duì)于極性、非極性和弱極性的揮發(fā)性小分子化合物具有很強(qiáng)的吸附能力?？紤]到土壤抑菌作用發(fā)生于自然條件下，參與抑菌過程的揮發(fā)性成分的沸程必然較

12、低，而且其中揮發(fā)性較強(qiáng)的極性、非極性和弱極性物質(zhì)都可能存在，故最終選擇75m CAR/PDMS纖維頭進(jìn)行揮發(fā)性抑菌物質(zhì)的測(cè)定。表1 不同SPME纖維頭的萃取能力比較萃取頭 75m CAR/PDMS 65m CW/DVB 65m PDMS/DVB 100m PDMS*出峰數(shù) 28 22 19 16檢出化合物數(shù)11 8 8 7*匹配率80萃取溫度、萃取時(shí)間也是SPME的重要影響因素。我們以空白牛肉膏蛋白胨液體培2.2 萃取條件優(yōu)化養(yǎng)基為測(cè)定樣品，選用75m CAR/PDMS萃取纖維頭，比較了不同萃取溫度：20、30、50、80、100，不同萃取時(shí)間：1min、5min、10min、20min、60

13、min對(duì)萃取結(jié)果的影響（表2）。表2 不同萃取條件對(duì)SPME-GC/MS的影響萃取條件溫度（） 時(shí)間（min）20出峰數(shù) 5可檢出化合物數(shù)11030 50 80 1001 55010 20 608 28 29 26 4 25 28 28 284 11 8 7 0 7 11 11 11萃取溫度低時(shí)，化合物不易揮發(fā)，頂空濃度較低，可吸附的化合物相對(duì)較少；溫度高時(shí)，化合物揮發(fā)性增強(qiáng)，頂空濃度增加，可吸附化合物較多，但多數(shù)化合物與萃取頭的吸附過程為放熱過程，高溫反而不利于萃取。故溫度在3050范圍較適于對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的吸附萃取。試驗(yàn)結(jié)果顯示：萃取時(shí)間10min，30以下時(shí)，出峰數(shù)和可檢出化合物種類很少；

14、50時(shí)，出峰數(shù)和可檢出化合物數(shù)分別達(dá)到28和11；而當(dāng)溫度升高至80時(shí)，出峰數(shù)雖有增加，但可檢出化合物數(shù)量明顯減少。故50為75m CAR/PDMS萃取纖維頭的較適吸附溫度。在同一溫度條件下，萃取纖維對(duì)待測(cè)物的萃取量與其在液相中的濃度和萃取時(shí)間成正比。50下，1min時(shí)，多數(shù)化合物與萃取涂層的吸附尚未達(dá)到平衡；5min時(shí)，揮發(fā)性較強(qiáng)的化合物，如苯甲醛、苯乙醛已達(dá)平衡；但揮發(fā)性較弱的組分，如癸醛、十八醛、2-十一烯醛、十六醇、十七醇、二十五烷等，要10min才能達(dá)到平衡。但繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，已無助于提高萃取效果。且如果系統(tǒng)氣密性不好，揮發(fā)性的化合物反而易于損失。另外，萃取溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)使

15、SPME纖維頭帶上大量水分，影響GC/MS的檢測(cè)和色譜柱壽命。2.3 強(qiáng)抑菌性土壤揮發(fā)性成分和強(qiáng)抑菌性土壤細(xì)菌揮發(fā)性代謝物分析土壤揮發(fā)性成分較為復(fù)雜，4種供試土樣鑒定出組分1621種（表3），占揮發(fā)性成分的80左右。同時(shí)存在于所有土樣中的組分有甲胺、三甲胺、二丁酮、二甲基二硫醚、3-甲基-2-戊酮、甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、苯、甲苯、乙基苯、苯甲醛、苯乙醛、N,N-二甲基辛胺、十九烷、二十烷等15種化合物。細(xì)菌發(fā)酵液中揮發(fā)性成分明顯較土壤中的簡(jiǎn)單。除去空白培養(yǎng)基中的揮發(fā)性成分，我們比較5株不同土壤來源的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)在其代謝產(chǎn)物中，普遍存在著三甲胺、二甲基二硫醚、3-甲基-2-戊酮、甲基吡嗪、

16、2，5-二甲基吡嗪、苯甲醛、N,N-二甲基辛胺、十九烷等易揮發(fā)性化合物。但從這些化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上看，沒有濃度特別高的主導(dǎo)化合物。另外，這些化合物累計(jì)在總揮發(fā)性成分中比例達(dá)到80%以上，再一次肯定了這個(gè)檢測(cè)方法的可行性。2.4 土壤揮發(fā)性成分和土壤細(xì)菌揮發(fā)性代謝物比較通過比較強(qiáng)抑菌性土壤和土壤細(xì)菌代謝物中的揮發(fā)性成分（表3，圖1），我們發(fā)現(xiàn)8種揮發(fā)性化合物，三甲胺、3-甲基2戊酮、二甲基二硫醚、甲基吡嗪、2，5二甲基吡嗪、苯甲醛、N,N-二甲基辛胺和十九烷，普遍存在于土壤和細(xì)菌代謝物中。除三甲胺曾被研究對(duì)Geotrichum candidum的孢子萌發(fā)有抑制作用外10，其它均未見報(bào)道。但它們很

17、可能就是參與土壤抑菌作用的主要揮發(fā)性物質(zhì)，并且很可能就是由土壤中的微生物，特別是細(xì)菌的代謝過程產(chǎn)生。堿性環(huán)境被認(rèn)為是導(dǎo)致土壤抑菌作用的一個(gè)重要因素，而三甲胺和N,N-二甲基辛胺都屬于胺類化合物，能夠使土壤pH升高，從而對(duì)真菌產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)然，揮發(fā)性化合物對(duì)真菌的抑制作用的機(jī)理不僅如此，它們還可能是引起真菌孢子細(xì)胞膜透性、滲透壓改變或介導(dǎo)某種反應(yīng)的關(guān)鍵因素。表3 典型強(qiáng)抑菌性土壤（X27）和土壤細(xì)菌（S7406）代謝物中揮發(fā)性成分化合物 甲胺 三甲胺 乙烷 3甲基戊烷 二丁酮 己烷 3-甲基2戊酮 二甲基二硫醚 甲基吡嗪 2，5二甲基吡嗪苯 乙基苯 甲苯 1，3二甲基苯 1，2二甲基苯苯甲醛

18、苯乙醛 N,N-二甲基辛胺壬醛 甲酸辛酯 十九烷 二十烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）土壤 2.98 4.07 1.39 3.15 9.81 3.74 4.81 5.72 1.34 2.67 1.79 0.43 5.67 1.14 4.38 3.81 0.35 0.21 0.44土壤細(xì)菌 5.82 5.66 1.38 3.29 5.24 6.37 4.05 4.96 6.59 4.18 2.94 5.47 圖1 典型強(qiáng)抑菌性土壤細(xì)菌揮發(fā)性成分和土壤揮發(fā)性成分總離子流圖A顯示強(qiáng)揮發(fā)性抑菌活性的細(xì)菌，B強(qiáng)揮發(fā)性抑菌活性的土壤。1 三甲胺，2 3-甲基-2-戊酮，3 二甲基二硫醚，4 甲基吡嗪，5 2,5-二甲基吡嗪，6 苯甲醛，7 辛醛，8 壬醛，9 癸醛，10 N,N-二甲基辛胺，11 (E)-2-癸烯醇，12 十九烷。3 結(jié)論從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，通過對(duì)SPME和GC/MS條件優(yōu)化，固相微萃取氣相色譜/質(zhì)譜法用于土壤揮發(fā)性成分和微生物揮發(fā)性代謝物檢測(cè)時(shí)，方法簡(jiǎn)便，并且可以達(dá)到很高的靈敏度。比較強(qiáng)抑菌性土壤揮發(fā)性成分和強(qiáng)抑菌性土壤細(xì)菌揮發(fā)性代謝物后，我們發(fā)現(xiàn)三甲胺、3-甲基-2-戊酮、二甲基二硫醚、甲基吡嗪、2，5-二甲基