實(shí)驗(yàn)一相差顯微鏡的使用

1、實(shí)驗(yàn)一 相差顯微鏡的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆障嗖铒@微鏡的原理、構(gòu)造及其使用方法。二、實(shí)驗(yàn)用品試劑：蒸餾水或生理鹽水。器材：相差顯微鏡（相差物鏡、轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器、調(diào)中合軸望遠(yuǎn)鏡、綠色濾色鏡） 、載玻片、 蓋玻片、牙簽、濾紙條、指甲油。三、實(shí)驗(yàn)原理光波有振幅（亮度） 、波長(zhǎng)（顏色）及相位（指在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置） 的不同。當(dāng)光通過(guò)物體時(shí)，如波長(zhǎng)和振幅發(fā)生變化，人們的眼睛才能觀察到，這就是普通顯 微鏡下能夠觀察到染色標(biāo)本的道理。 而活細(xì)胞和未經(jīng)染色的生物標(biāo)本， 因細(xì)胞各部微細(xì)結(jié)構(gòu) 的折射率和厚度略有不同，光波通過(guò)時(shí)， 波長(zhǎng)和振幅并不發(fā)生變化，僅相位有變化 （相應(yīng)發(fā) 生的差異即相差） ，而這種微

2、小的變化，人眼是無(wú)法加以鑒別的，故在普通顯微鏡下難以觀 察到。 相差顯微鏡能夠改變直射光或衍射光的相位， 并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象， 把相差 變成振幅差（明暗差） ，同時(shí)它還吸收部分直射光線，以增大其明暗的反差。因此可用以觀 察活細(xì)胞或未染色標(biāo)本。 相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要不同之處是： 用環(huán)狀光闌代替可變 光闌，用帶相板的物鏡 （通常標(biāo)有 PH 的標(biāo)記）代替普通物鏡， 并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。 環(huán)狀光闌是由大小不同的環(huán)狀孔形成的光闌，它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的。 其作用是將直射光所形成的像從一些衍射旁像中分出來(lái)。 相板安裝在物鏡的后焦面處， 相板 裝有吸收光線的吸收膜和推遲

3、相位的相位膜。 它除能推遲直射光線或衍射光的相位以外， 還 有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。 調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡是用來(lái)進(jìn)行合軸調(diào)節(jié)的。 相差顯微鏡在使用時(shí)， 聚光鏡下面環(huán)狀光闌的中心與物鏡光軸要完全在一直線上， 必需調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相板的環(huán) 狀圈重合對(duì)齊， 才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。 否則直射光或衍射光的光路紊亂， 應(yīng)被吸收的 光不能吸收，該推遲相位的光波不能推遲，就失去了相差顯微鏡的作用。1.相差 同一光線經(jīng)過(guò)折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位是在某一時(shí)間上， 光的波動(dòng)所達(dá)到的位置。 一般由于被檢物體（如不染色的細(xì)胞）所能產(chǎn)生的相差太小， 我們 的眼睛很難分辨出這種差別的，只有變相差為振

4、幅差（明暗之差） ，才能被分辨。當(dāng)光波通 過(guò)兩種折射率不同的物質(zhì)時(shí)，如由空氣T水，或空氣玻璃，其波長(zhǎng)、振幅和相位均有不同變化。如光波通過(guò)1cm厚的水和1cm厚的玻璃時(shí)，由于兩者折射率不同， 通過(guò)它們的光波在相 位上產(chǎn)生一定的差異。 通過(guò)玻璃的光波相位落后， 因?yàn)椴ＡУ拿芏群驼凵渎时人螅?所以光 波的波長(zhǎng)和頻率都小于水。 相差決定于光波通過(guò)介質(zhì)的折射率之差及其厚度， 等于折射率與 厚度的乘積之差（光程之差） 。介質(zhì)越厚或折射率越大光波減速也越大，即相差顯微鏡就是 利用被檢物的光程之差進(jìn)行鏡檢的。2. 折射與干擾 肉眼看不見(jiàn)的相差，只要利用衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成明暗的振幅差就可能看見(jiàn)。（1

5、）衍射波在同一介質(zhì)里傳播是沿直線方向傳播， 如果在它傳播的方向上， 遇到迎面檔住的孔或 障礙物不比它的波長(zhǎng)大很多， 這次波就會(huì)明顯地繞到障礙物后面或孔的外面去 （傳播路線發(fā) 生彎曲），這種現(xiàn)象叫著波的衍射。（2）干涉在同一種媒質(zhì)里傳播的兩列波， 如果頻率與波長(zhǎng)同， 在兩列波相交的區(qū)域里， 由于疊加 的結(jié)果，每一點(diǎn)的合振幅都是一定的，并且出現(xiàn)振動(dòng)加強(qiáng)或減弱， 這就是波的干涉現(xiàn)象。光 通過(guò)小顆粒的物體后產(chǎn)生直射光和衍射光， 衍射光的光波振幅小， 相位滯后。 在光學(xué)系統(tǒng)中， 這兩種光相遇或光的疊加，振幅發(fā)生變化，光線或明或暗，這就是光的干涉現(xiàn)象。 如果物體 粒子是折射率稍大于周?chē)劫|(zhì)的極小的透明體時(shí)

6、，由于光程 （折射率與厚度的乘積） 比較大，所以通過(guò)粒子的光比周?chē)墓庠谙辔簧嫌兴七t。 這是因?yàn)楸粰z粒子的衍射光相位比折射光 相位大約遲 1/4 波長(zhǎng)的緣故。 若是在直射光的通過(guò)點(diǎn)和大部分的衍射光的通過(guò)面放置吸收光 的物質(zhì)或推遲相位的物質(zhì)時(shí)， 就能分別改變直射光和衍射光的相位和振幅。 如果把直射光相 位推遲1/4波長(zhǎng)，使與衍射光保持同一相位，合成波（P）等于直射光與衍射光的振幅之和（ P=S+D ），振幅加大，亮度提高。相反地，把衍射光相位推遲1/4 波長(zhǎng)，兩者的相差變?yōu)?/2波長(zhǎng)，合成波的振幅等于兩波的振幅差（P=S-D），這時(shí)亮度減弱變暗。光線的相位肉眼是看不見(jiàn)的，但利用衍射和干涉的現(xiàn)象

7、把相位差變?yōu)檎穹睿靼捣床睿┚湍苡萌庋圩R(shí)別。 衍射光的相位比直射光推遲 1/4波長(zhǎng)，合成波由與兩者干涉而生成，形成被檢物體的像，振 幅與 S 同，相位稍延遲。3. 相板的作用為了達(dá)到相差效應(yīng)， 在相差顯微鏡的物鏡中， 裝有由光學(xué)玻璃制成的相板。 在圓形相的 平面上，有一圈與周?chē)ɡ锿猓┫喟搴穸炔煌幕蛲够虬嫉膱A環(huán)。相板分兩部分：（1 ）共軛面：通常為環(huán)狀，是直射光通過(guò)部分。其環(huán)是凸起的，也可能是凹陷的。（ 2 ）補(bǔ)償面：共軛面內(nèi)外兩側(cè)部分，是通過(guò)衍射光的部分。在相板的共軛面和補(bǔ)償面上， 涂有改變光波相位或吸收光線的物質(zhì)， 當(dāng)光線通過(guò)時(shí)， 使 光波的相位或振幅改變， 從而達(dá)到不同目的的觀察效果

8、。 利用相板把光波相位推遲， 振幅改 變。相板的作用，除推遲直射光和衍射光的相位之外，還有吸收光，使亮度改變。物鏡的后 焦點(diǎn)位于透鏡中間而相板位于物鏡的后焦面上，所以，相板也安裝在透鏡中間。 不同種類(lèi)的相板對(duì)光吸收率不同，產(chǎn)生不同的反差效果，從反差上可分成兩大類(lèi)：（A ）明反差或負(fù)反差：在相差顯微鏡的視場(chǎng)中，物象亮度大于背景亮度的現(xiàn)象。在被檢物 體的折射率大于媒質(zhì)時(shí)，被相板的共軛面（因?yàn)樵诠曹椕嫔贤坑懈淖兿辔缓臀展獾奈镔|(zhì)） 推遲1/4波長(zhǎng)，同時(shí)吸收 80%t90%振幅變小，致使僅由直射光照射的背景變暗。通過(guò)補(bǔ) 償面的衍射光沒(méi)有變化， 由于直射光推遲 1/4 波長(zhǎng)，兩者 （直射光與衍射光） 有

9、完全相同的 相位，合成波 P等于直射光（S）與衍射光（D）之和（P=S+D）,故振幅加大。物象是這兩 種波的合成波造成，即物象等于P,所以只有直射光照射的背景亮得多。（B）暗反差或正反差：在相差顯微鏡的視場(chǎng)中，背景亮度大于物象亮度的現(xiàn)象。與明反差 相反，把通過(guò)補(bǔ)償面（涂有改變直射光相位的物質(zhì)）的衍射光推遲1/4波長(zhǎng)，使衍射光與直射光的相位相差 1/2 波長(zhǎng)，同時(shí)，直射光在共軛面（涂有吸光物質(zhì)）被部分吸收。由于兩者 在像點(diǎn)相互干涉的結(jié)果，使合成波振幅變小，被檢物的影象比背景變暗。4. 光路與成像相差顯微鏡的照明光束， 由轉(zhuǎn)盤(pán)聚焦器環(huán)狀光闌的環(huán)狀孔射入聚光鏡， 投射載物臺(tái)上的 被檢樣品，經(jīng)樣品后，

10、入射光除投射的直射光外，同時(shí)產(chǎn)生衍射光。衍射光的振幅較小，相 位滯后直射光和衍射光進(jìn)入物鏡， 前者由環(huán)狀的共軛面、 后者由較大的補(bǔ)償面透過(guò)相板， 并 相互干涉造像。樣品的影象由直射光（S）和衍射光（D ）經(jīng)干涉后的合成波造成，背景僅由直射光形成。 由于直射光和衍射光兩種光波的相位差異不同造成不同的反差效果， 或明反 差或暗反差不等視所用物鏡的相板類(lèi)型而定。四、裝置1. 相差物鏡在相差物鏡內(nèi)的后焦面上裝有不同的相板， 造成視場(chǎng)中被檢樣品影象與背景不同的明暗 反差。物鏡在明暗反差上可區(qū)分為兩大類(lèi)：即明反差（B）或負(fù)反差（N）物鏡和暗反差（D）或正反差（P）物鏡，標(biāo)志在物鏡外殼上，并兼有高（H）、中

11、（M ）、低（L）等不同反應(yīng)。有的相差顯微鏡用 ph 字樣表示。相差物鏡多為消色差物鏡或平場(chǎng)消色差物鏡。2. 轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器 由聚光鏡和環(huán)狀光闌構(gòu)成。環(huán)狀光闌位于聚光器之下，由不同大小的環(huán)狀通光孔構(gòu)成，環(huán)狀光闌的環(huán)寬與直徑各不相同， 與不同放大率的相差物鏡內(nèi)的相板相匹配， 不可濫用。 轉(zhuǎn) 盤(pán)前端朝向使用者一面有標(biāo)示窗（孔） ，轉(zhuǎn)盤(pán)上的不同部位有 0、 1、 2、 3 和 4或 0、 10、 20、 40和 100字樣。 0表示非相差的明視場(chǎng)的普通光闌； 1或 10、 2或 20、 3或 30、 4或100， 標(biāo)示與相應(yīng)放大率的相差物鏡相匹配的不同規(guī)格的環(huán)狀光闌的標(biāo)志。3. 合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡（ CT

12、）又名合軸調(diào)中目鏡， 作為環(huán)狀光闌的環(huán)孔 （亮環(huán)） 與相差物鏡相板的共軛面環(huán)孔 （暗環(huán)） 的調(diào)中合軸與調(diào)焦之用。 使用時(shí)， 轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器的環(huán)狀光闌與相差物鏡必須匹配， 且環(huán)狀光闌 的環(huán)孔與相差物鏡相板的共軛面環(huán)孔在光路中要準(zhǔn)確合軸，并完全吻合或重疊， 以保證直射光和衍射光各行其道，使成像光線的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢?jiàn)的振幅差。4. 綠色濾色鏡從色差的消除情況看，分為多束消色差物鏡或 PL 物鏡。消色差物鏡的最佳清晰范圍的 光譜區(qū)510-630nm。欲提高相差顯微鏡性能最好以波長(zhǎng)范圍小的單色照明，故在光路上加用透射光線波長(zhǎng)為 500-600nm 左右的綠色濾色鏡，使照明光線中的紅、藍(lán)光被吸收，只透過(guò) 綠光

13、，可提高物鏡的分辨能力。五、操作1. 相差裝置的安裝相差顯微鏡區(qū)別于普通顯微鏡的裝置主要有相差物鏡、轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器、 合軸調(diào)中目鏡和綠色濾色鏡四種部件。（ 1）相差物鏡的安裝從物鏡轉(zhuǎn)換器上拆下普通物鏡，旋入相差物鏡，與普通目鏡配套使用。（ 2）轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器的調(diào)換安裝旋轉(zhuǎn)聚光器升降螺旋， 把普通明視場(chǎng)聚光器至最低位， 放松固緊螺絲， 卸下普通顯微鏡 使用的聚光器。 把轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器安放到相應(yīng)位置上， 旋緊固緊螺絲， 轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器升降螺旋，使 升至最高位置。 標(biāo)示孔朝向操作者。 將環(huán)狀光闌裝在聚光器支架上， 把綠色濾光片放在上面。 再?gòu)霓D(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。2. 聚光器調(diào)中 轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器調(diào)換安裝后

14、，要進(jìn)行合軸調(diào)中，使聚光器的光軸與顯微鏡的主光軸合一。方法：（1）旋轉(zhuǎn)集光器轉(zhuǎn)盤(pán)的環(huán)狀光闌，將“0”位對(duì)準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器的明視場(chǎng)照明用的普通可變光闌進(jìn)入光路。（2）旋轉(zhuǎn)聚光器升降螺旋，升至最高位。（3）打開(kāi)光源，使視場(chǎng)明亮。（4）把被檢樣品放到載物臺(tái)上，用低倍（4x ）物鏡聚焦。（5）縮小鏡座上的視場(chǎng)光闌開(kāi)口，至最小。（6）從目鏡觀察，在視場(chǎng)中可見(jiàn)一縮小的、明亮的、多角形的視場(chǎng)光闌圖象。（7）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)聚光器的兩個(gè)調(diào)中桿，推動(dòng)聚光器，把視場(chǎng)中的明亮的多角形的視場(chǎng)光 闌圖象，調(diào)至視場(chǎng)中央。（8）開(kāi)放視場(chǎng)光闌至視場(chǎng)同大，兩者周邊完全重合。否則，重新調(diào)中。3. 相板圓環(huán)與環(huán)狀光闌圓環(huán)的合軸調(diào)中拔

15、出目鏡， 插入合軸望遠(yuǎn)鏡，一邊從望遠(yuǎn)鏡內(nèi)觀察，并用左手固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)望遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其下降， 當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)，此時(shí)可將望遠(yuǎn)鏡固定住。 再升降集光器并調(diào)節(jié)其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致， 然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀 光闌聚光器上的調(diào)節(jié)鈕， 使兩環(huán)完全重合， 如亮環(huán)比黑環(huán)小而位于內(nèi)側(cè)時(shí)， 應(yīng)降低集光器使 亮環(huán)放大；反之，則應(yīng)升高聚光器，使亮環(huán)縮小。如若升到最高限度仍不能完全重合，則可 能是載玻片過(guò)厚之故，應(yīng)更換。合軸調(diào)整完畢，抽出望遠(yuǎn)鏡，換回目鏡，按常規(guī)要領(lǐng)進(jìn)行觀 察。在更換不同倍率的相差物鏡時(shí)， 每一次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合軸調(diào)整。 使 用油鏡時(shí)， 集

16、光器上透鏡表面與載玻片之間要同時(shí)加上香柏油。 在視場(chǎng)中看見(jiàn)環(huán)狀光闌為一 明亮的圓環(huán)，而相板的圓環(huán)為一暗環(huán)，使用時(shí)兩者要合軸，互相重疊。方法：（ 1） 相差物鏡與環(huán)狀光闌的匹配。如 40x 相差物鏡的環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)向 ph3 或 40，使相應(yīng)的 環(huán)狀光闌進(jìn)入光路。（2）把CT放入目鏡筒。觀察視場(chǎng)中明環(huán)與暗環(huán)圖象。（3）聚焦。轉(zhuǎn)動(dòng)CT目鏡可調(diào)部分至清晰地看見(jiàn)明暗環(huán)。（4）與暗環(huán)的調(diào)中重疊。相板的暗環(huán)是固定不動(dòng)的，處于光路之中，暗環(huán)的中心。環(huán)狀 光闌的亮環(huán)可調(diào)節(jié)。4. 相差物鏡的選擇20XPH=20倍，正反差，反差程度高40XPM=40倍，正反差，反差程度中等100XPL=100倍，正反差，反差程度低4

17、0XNH=40倍，負(fù)反差，反差程度高4OXNM=40咅，負(fù)反差，反差程度中等100XNL=100倍，負(fù)反差，反差程度低100 XDH=100倍，暗反差，反差程度咼 4OXDM=40咅，暗反差，反差程度中等 20XDL=20倍，暗反差，反差程度低 10XBH=10倍，明反差，反差程度高 20XBM=20倍，明反差，反差程度中等 40XBL=20倍，明反差，反差程度低相差物鏡應(yīng)用范圍標(biāo)示反差應(yīng)用P正觀察細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)N負(fù)觀察微小物體如孢子、鞭毛和活的樣品H高樣品本身反差低的L低樣品本身反差咼的M中樣品本身反差中等的六、實(shí)驗(yàn)步驟1.取一張潔凈的載玻片，滴一滴生理鹽水或蒸餾水，用牙簽刮自己的口腔粘膜少許與水混勻， 蓋上蓋玻片。2.10 相差物鏡旋入光路。3. 將相應(yīng)于10X相差物鏡的聚光器環(huán)狀光闌移入光路中，完全打開(kāi)聚光器孔徑光闌。4. 將樣品置于載物臺(tái)上，聚焦樣品。5. 調(diào)節(jié)聚光器。6. 觀察物鏡后焦面，調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像和相板中圓環(huán)互相吻合。具體方法：取下一個(gè)目鏡， 插入聚焦望遠(yuǎn)鏡，轉(zhuǎn)