熒光分析法課件

1、熒光分析法1第十一章 熒光分析法（Fluorescence）熒光分析法2概述概述n分子發(fā)光（分子發(fā)光（molecular luminescence） 某些物質(zhì)分子吸收能量躍遷到較高的電子激發(fā)態(tài)后，某些物質(zhì)分子吸收能量躍遷到較高的電子激發(fā)態(tài)后，返回基態(tài)的過(guò)程中伴隨發(fā)光的現(xiàn)象。返回基態(tài)的過(guò)程中伴隨發(fā)光的現(xiàn)象。M+ 能量能量 MM熒光分析法3分類(lèi)分類(lèi) 光致發(fā)光（光致發(fā)光（PL）生物發(fā)光（生物發(fā)光（BL）化學(xué)發(fā)光（化學(xué)發(fā)光（CL）電致發(fā)光（電致發(fā)光（EL）磷光磷光熒光熒光熒光分析法熒光分析法: 根據(jù)物質(zhì)所發(fā)射的熒光譜線的位置及強(qiáng)度進(jìn)行物根據(jù)物質(zhì)所發(fā)射的熒光譜線的位置及強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。

2、質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。原子熒光原子熒光紫外可見(jiàn)熒光紫外可見(jiàn)熒光紅外熒光紅外熒光X射線熒光射線熒光分子熒光分子熒光光致發(fā)光：光致發(fā)光：分子吸收某種波長(zhǎng)的光后發(fā)射出分子吸收某種波長(zhǎng)的光后發(fā)射出比原來(lái)吸收光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光的現(xiàn)象。比原來(lái)吸收光的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光的現(xiàn)象。M+ h MMh 熒光熒光：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射的光。返回基態(tài)時(shí)發(fā)射的光。熒光分析法4第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法的基本原理熒光分析法的基本原理 一、分子熒光 （一）分子熒光的產(chǎn)生 1.分子的電子能級(jí)與激發(fā)過(guò)程 分子的電子能級(jí)中包括振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能

3、級(jí)根據(jù)“能量最低原則”和“Pauli不相容原則”，基態(tài)時(shí)分子中的電子對(duì)填充在能量最低的軌道，且自旋相反，即總自旋量子數(shù)s為0基態(tài)基態(tài)電子能級(jí)多重性：M2s+1 單重態(tài)S M1 自旋相反 三重態(tài)T M3 自旋相同熒光分析法5被激發(fā)躍遷過(guò)程中：通常電子不發(fā)生自旋方向的改變,電子對(duì)自旋相反，總自旋量子數(shù)s為0,處于激發(fā)單重態(tài)。電子發(fā)生自旋方向的改變,電子對(duì)自旋相同，總自旋量子數(shù)s為1,處于激發(fā)三重態(tài)，比激發(fā)單重態(tài)能量低。熒光分析法62.熒光的產(chǎn)生吸收紫外可見(jiàn)光，基態(tài)電子躍遷到單重激發(fā)態(tài)的各個(gè)不同能級(jí)上。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，釋放能量返回基態(tài)。發(fā)射熒光是其中一條途徑。能量：能量： S2 T2 S1 T1 S0

4、熒光分析法7熒光分析法8熒光分析法91）振動(dòng)弛豫）振動(dòng)弛豫 激發(fā)態(tài)分子通過(guò)與溶劑分子碰撞而將部分能量傳激發(fā)態(tài)分子通過(guò)與溶劑分子碰撞而將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子由遞給溶劑分子，其電子由同一電子能級(jí)同一電子能級(jí)激發(fā)態(tài)的較激發(fā)態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)回到最低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。高振動(dòng)能級(jí)回到最低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。10-12 s2）內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換）內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換 兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)能級(jí)相差較小，振動(dòng)能級(jí)部分重兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)能級(jí)相差較小，振動(dòng)能級(jí)部分重疊，電子由高電子能級(jí)轉(zhuǎn)移到低電子能級(jí)的過(guò)程。疊，電子由高電子能級(jí)轉(zhuǎn)移到低電子能級(jí)的過(guò)程。熒光分析法10熒光分析法111）振動(dòng)弛豫）振動(dòng)弛豫 激發(fā)態(tài)分子通過(guò)與溶劑分子碰撞而

5、將部分能量傳激發(fā)態(tài)分子通過(guò)與溶劑分子碰撞而將部分能量傳遞給溶劑分子，其電子由遞給溶劑分子，其電子由同一電子同一電子激發(fā)態(tài)的較高振激發(fā)態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)回到較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。動(dòng)能級(jí)回到較低振動(dòng)能級(jí)的過(guò)程。1012 2）內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換）內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換 兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)能級(jí)相差較小，振動(dòng)能級(jí)部分重兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)能級(jí)相差較小，振動(dòng)能級(jí)部分重疊，電子由高電子能級(jí)轉(zhuǎn)移到低電子能級(jí)的過(guò)程。疊，電子由高電子能級(jí)轉(zhuǎn)移到低電子能級(jí)的過(guò)程。熒光分析法12熒光分析法133）外部能量轉(zhuǎn)換）外部能量轉(zhuǎn)換 激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子碰撞以熱激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子碰撞以熱的形式釋放能量。發(fā)生在第一激發(fā)態(tài)或激發(fā)三

6、重態(tài)的形式釋放能量。發(fā)生在第一激發(fā)態(tài)或激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程。最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程。4）體系間跨越）體系間跨越 不同多重態(tài)不同多重態(tài),有重疊的振動(dòng)能級(jí)，分子由激發(fā)單重有重疊的振動(dòng)能級(jí)，分子由激發(fā)單重態(tài)跨越到激發(fā)三重態(tài)的過(guò)程，電子自旋反轉(zhuǎn)。態(tài)跨越到激發(fā)三重態(tài)的過(guò)程，電子自旋反轉(zhuǎn)。熒光分析法14熒光分析法153）外部能量轉(zhuǎn)換）外部能量轉(zhuǎn)換 激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子碰撞以熱激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子碰撞以熱的形式釋放能量。發(fā)生在第一激發(fā)態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的形式釋放能量。發(fā)生在第一激發(fā)態(tài)或激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程。最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程。4）體

7、系間跨越）體系間跨越 不同多重態(tài)不同多重態(tài),有重疊的振動(dòng)能級(jí)，分子由激發(fā)單重有重疊的振動(dòng)能級(jí)，分子由激發(fā)單重態(tài)跨越到激發(fā)三重態(tài)的過(guò)程，電子自旋反轉(zhuǎn)。態(tài)跨越到激發(fā)三重態(tài)的過(guò)程，電子自旋反轉(zhuǎn)。熒光分析法16熒光分析法175）熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)）熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài)(S1 S0)發(fā)射熒光的過(guò)程約為：發(fā)射熒光的過(guò)程約為： 10-710 -9 s 。由于振動(dòng)弛豫由于振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換損失部分能量，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，和內(nèi)轉(zhuǎn)換損失部分能量，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)要長(zhǎng)；波長(zhǎng)要長(zhǎng)； 6）磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振

8、動(dòng)能級(jí)）磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)基態(tài) （ T1 S0躍遷躍遷）；磷光能量更低，波長(zhǎng)更長(zhǎng)。）；磷光能量更低，波長(zhǎng)更長(zhǎng)。發(fā)光速度很慢：發(fā)光速度很慢： 10-410 s ，光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間，光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間單重基態(tài)單重基態(tài)(s0)受激分子受激分子S1T1系間竄躍系間竄躍T1的最低振動(dòng)能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)磷光磷光振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫熒光分析法18 （二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 1.激發(fā)光譜：激發(fā)光譜： 表示不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)表示不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā) 射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。 熒光強(qiáng)度（熒

9、光強(qiáng)度（F）與激發(fā)波長(zhǎng)（）與激發(fā)波長(zhǎng)（exex） 的關(guān)系曲線的關(guān)系曲線。 2.發(fā)射光譜（熒光光譜）：發(fā)射光譜（熒光光譜）： 保持激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，保持激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，測(cè)定發(fā)射的熒光在各個(gè)波長(zhǎng)下的相對(duì)強(qiáng)度，測(cè)定發(fā)射的熒光在各個(gè)波長(zhǎng)下的相對(duì)強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度（記錄熒光強(qiáng)度（F）對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)（）對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)（em） 的關(guān)系曲線的關(guān)系曲線。熒光分析法193.溶液熒光光譜的特征溶液熒光光譜的特征 1）斯托克斯位移）斯托克斯位移 發(fā)射波長(zhǎng)總大于激發(fā)波長(zhǎng)的現(xiàn)象。發(fā)射波長(zhǎng)總大于激發(fā)波長(zhǎng)的現(xiàn)象。 原因：內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫；激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子原因：內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫；激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子 的相互作用；返回到基態(tài)的

10、不同振動(dòng)能級(jí)的相互作用；返回到基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí) 2）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量， 產(chǎn)生不同吸收帶，但發(fā)射的熒光光譜只有一個(gè)發(fā)射帶。產(chǎn)生不同吸收帶，但發(fā)射的熒光光譜只有一個(gè)發(fā)射帶。原因：均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到原因：均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光?；鶓B(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。熒光分析法203）熒光光譜與激發(fā)光譜鏡像關(guān)系）熒光光譜與激發(fā)光譜鏡像關(guān)系通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜

11、（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似；動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似；熒光分析法21200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l熒光分析法22二、熒光與分子結(jié)構(gòu)二、熒光與分子結(jié)構(gòu)1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件 1）具有合適的結(jié)構(gòu)）具有合適的結(jié)構(gòu)有強(qiáng)的紫外可見(jiàn)吸收；有強(qiáng)的紫外可見(jiàn)吸收； 2

12、）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率：熒光量子產(chǎn)率：2.熒光壽命：除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)熒光壽命：除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需要的時(shí)間所需要的時(shí)間f發(fā)射熒光的光子數(shù)吸收激發(fā)光的光子數(shù)熒光分析法232.分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 1）躍遷類(lèi)型：）躍遷類(lèi)型： * 的熒光效率高的熒光效率高,有較強(qiáng)紫外有較強(qiáng)紫外吸收，有利于熒光的產(chǎn)生；吸收，有利于熒光的產(chǎn)生； 2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率 并產(chǎn)生紅移并產(chǎn)生紅移 熒光分析法243）剛性平面結(jié)構(gòu)：可

13、降低分子振動(dòng)，減少與溶劑）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。 熒光分析法254）取代基效應(yīng)）取代基效應(yīng)給電子取代基給電子取代基-OH,-CN，-NH2等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)熒光等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)熒光得電子取代基得電子取代基=C=O, -NO2-COOH，-SH等減弱熒光等減弱熒光重原子效應(yīng)：重原子效應(yīng)：芳環(huán)上取代芳環(huán)上取代F、Cl、Br、I之后，系間竄躍加強(qiáng)，熒光之后，系間竄躍加強(qiáng)，熒光強(qiáng)度隨鹵素原子量

14、增加而減弱。強(qiáng)度隨鹵素原子量增加而減弱。取代基的位置：取代基的位置：鄰、對(duì)位熒光增強(qiáng)，鄰、對(duì)位熒光增強(qiáng)，間位抑制間位抑制給電子取代基給電子取代基-OH,-CN，-NH2等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)熒光等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)熒光得電子取代基得電子取代基=C=O, -NO2-COOH，-SH等減弱熒光等減弱熒光給電子取代基給電子取代基-OH,-CN，-NH2等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)熒光等，可擴(kuò)大共軛雙鍵體系加強(qiáng)熒光得電子取代基得電子取代基=C=O, -NO2-COOH，-SH等減弱熒光等減弱熒光熒光分析法263.熒光試劑能與弱熒光物質(zhì)作用，得到強(qiáng)熒光行產(chǎn)物。1) 熒光胺本身不顯熒光，能與脂肪族

15、、芳香伯胺形成熒光衍生物。ex=275、390nm，em=480nm2)鄰苯二甲醛（OPA）伯胺，-氨基酸 ex=340nm ,em=455nm3）丹酰氯含伯、仲胺及酚基的生物堿 丹酰肼可的松的羰基 ex=365nm ,em=500nm4）無(wú)機(jī)離子 能與某些有機(jī)物形成熒光配合物熒光分析法27三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.溫度的影響溫度的影響熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，分子間碰撞次數(shù)增加，熒光效率、強(qiáng)度溫度增加，分子間碰撞次數(shù)增加，熒光效率、強(qiáng)度 降低降低溫度降低，溫度降低，f、If增大增大。2.溶劑的影響溶劑的影響除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的

16、極性、氫鍵、配位鍵的形除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光光譜發(fā)生變化成都將使化合物的熒光光譜發(fā)生變化, 熒光波長(zhǎng)隨著熒光波長(zhǎng)隨著溶劑極性的增強(qiáng)而長(zhǎng)移，強(qiáng)度增強(qiáng)。溶劑極性的增強(qiáng)而長(zhǎng)移，強(qiáng)度增強(qiáng)。熒光分析法283. 溶液溶液pH對(duì)酸堿熒光物，對(duì)酸堿熒光物，pH影響離解、型體分布，從而影影響離解、型體分布，從而影響熒光強(qiáng)度，需要嚴(yán)格控制。響熒光強(qiáng)度，需要嚴(yán)格控制。OHO_OHH+_pH1有熒光有熒光pH13無(wú)熒光無(wú)熒光熒光分析法294.熒光熄滅劑熒光熄滅劑 1）熒光猝滅）熒光猝滅熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起

17、熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。2）熒光熄滅劑：）熒光熄滅劑：使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)又稱(chēng)為熒使熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)又稱(chēng)為熒光猝滅劑。光猝滅劑。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羧基化合物等。 熒光分析法303）機(jī)理：）機(jī)理： a碰撞失去能量 b生成不發(fā)光的配合物 c溶解氧的存在使熒光物質(zhì)氧化或氧分子的順磁性 使激發(fā)單重態(tài)分子轉(zhuǎn)變?yōu)槿貞B(tài) d濃度較大，自熄滅現(xiàn)象 熒光分析法315.散射光散射光 瑞利光：彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，僅改變方向，瑞利光：彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，僅改變方向， 波長(zhǎng)與入射光相同波長(zhǎng)與入射光相同 拉曼光：非彈性碰撞，改變方向同時(shí)能量交換，波

18、長(zhǎng)拉曼光：非彈性碰撞，改變方向同時(shí)能量交換，波長(zhǎng) 長(zhǎng)移或短移。長(zhǎng)移或短移。 散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾 尤其是波長(zhǎng)與熒光波長(zhǎng)接近的拉曼光尤其是波長(zhǎng)與熒光波長(zhǎng)接近的拉曼光 選擇適當(dāng)?shù)娜軇┖图ぐl(fā)波長(zhǎng)，可消除拉曼光的干擾選擇適當(dāng)?shù)娜軇┖图ぐl(fā)波長(zhǎng)，可消除拉曼光的干擾 熒光分析法32320360448350448320360350400激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm0.1mol/LH2SO4激發(fā)350nm0.1mol/LH2SO4強(qiáng)度強(qiáng)度/nm/nm熒光分析法33第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法一、 特點(diǎn) 1.靈敏度高 比紫外-可見(jiàn)分光光度法高

19、24個(gè)數(shù)量級(jí)； 檢測(cè)下限：10-1010-12g/ml 2.選擇性強(qiáng) 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜； 3.試樣量少 缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。熒光分析法34二、定量依據(jù)與方法 1.定量依據(jù) 熒光強(qiáng)度F正比于吸收的光強(qiáng)（I0I） 濃度很低時(shí)(Ecl0.05) ，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：0()FK II00lg10EclIAEclIII 2.300(1 10)(1)ElcElcFK IK Ie02.3FK I EclKc熒光分析法35FKc 2.定量方法 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法： 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng) 度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度； FKc熒

20、光分析法362）比例法：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度0000ssxxsxxsFFcFFccFFcFF3）多組分樣品的熒光分析 a無(wú)相互干擾，分別測(cè)定 b有干擾，同紫外可見(jiàn)吸收光譜定量方法 解聯(lián)立方程組法 等吸收雙波長(zhǎng)消去法熒光分析法37第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)1.測(cè)量熒光的儀器主要由四個(gè)部分組成： 激發(fā)光源、雙單色器系統(tǒng)、樣品池、檢測(cè)器。2.特殊點(diǎn)：有激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通 常成直角。3.光源：氙燈（250-700nm） 單色器：選擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器和選擇發(fā)射光 (測(cè)量)波長(zhǎng)的第二單色器； 樣品池：石英比色皿 檢測(cè)器：光電倍增管。熒光分析法38熒

21、光分析法39熒光分析法402.儀器的校正儀器的校正（1）靈敏度校正：）靈敏度校正：最低信號(hào)、最低信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度最低信號(hào)、最低信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度1g/ml硫酸奎寧作對(duì)照品溶液。硫酸奎寧作對(duì)照品溶液。（2）波長(zhǎng)校正）波長(zhǎng)校正汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線校正汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線校正（3）光譜的校正）光譜的校正 熒光分析法41其他熒光分析技術(shù)（自學(xué)）其他熒光分析技術(shù)（自學(xué)） 1.激光熒光分析激光熒光分析 單色性極好，提高熒光分析的靈敏度和選擇性單色性極好，提高熒光分析的靈敏度和選擇性 2.時(shí)間分辨熒光分析時(shí)間分辨熒光分析 利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測(cè)之間利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測(cè)之間延緩的時(shí)

22、間不同，實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)的目的。選擇合適的延緩的時(shí)間不同，實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)的目的。選擇合適的延緩時(shí)間，可測(cè)定被測(cè)組分的熒光不受其他組分的熒延緩時(shí)間，可測(cè)定被測(cè)組分的熒光不受其他組分的熒光及噪聲影響光及噪聲影響 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)熒光分析法42根據(jù)熒光產(chǎn)生時(shí)間和衰減速率的差異。對(duì)不同組根據(jù)熒光產(chǎn)生時(shí)間和衰減速率的差異。對(duì)不同組分進(jìn)行分析分進(jìn)行分析熒光分析法433.同步熒光分析同步熒光分析 選擇選擇（通常（通常 ），同步變化發(fā)），同步變化發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，得到同步熒光光譜射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，得到同步熒光光譜（熒光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的圖譜）（熒光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的圖譜）特點(diǎn)：

23、譜圖簡(jiǎn)化、選擇性提高、光散射干擾減少特點(diǎn)：譜圖簡(jiǎn)化、選擇性提高、光散射干擾減少maxmaxemexll熒光分析法44同步掃描技術(shù)同步掃描技術(shù) 根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過(guò)程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差關(guān)系，同步掃描可分為固定波長(zhǎng)差( (ll) )和固定能量差及可和固定能量差及可變波長(zhǎng)三種；變波長(zhǎng)三種； 同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜同步掃描技術(shù)可簡(jiǎn)化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率； 如圖。 合適的合適的ll可可減少光譜重疊減少光譜重疊；酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似 ， 發(fā) 射 光 譜 嚴(yán) 重 重 疊 ， 但l60nm時(shí)，只顯

24、示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。熒光分析法454.4.膠束增敏熒光分析膠束增敏熒光分析 當(dāng)單體表面活性劑濃度增大到臨界膠束濃度，當(dāng)單體表面活性劑濃度增大到臨界膠束濃度，會(huì)締合為球狀膠束，會(huì)締合為球狀膠束， 利用膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)有利用膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)有增溶、增敏和增穩(wěn)的作用增溶、增敏和增穩(wěn)的作用，對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行保護(hù)對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行保護(hù)熒光分析法46熒光分析法的應(yīng)用1.無(wú)機(jī)化合物的分析與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定

25、；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定2.生物與有機(jī)化合物的分析熒光分析法471.1.電子受激發(fā)躍遷到激發(fā)態(tài)后，返回基態(tài)的過(guò)程中，電子受激發(fā)躍遷到激發(fā)態(tài)后，返回基態(tài)的過(guò)程中，有哪些釋放能量的途徑有哪些釋放能量的途徑2.2.熒光光譜的特征？熒光光譜的特征？3.3.產(chǎn)生熒光必須具備的條件產(chǎn)生熒光必須具備的條件? ?4.4.影響熒光強(qiáng)度的因素影響熒光強(qiáng)度的因素? ?5.5.測(cè)量熒光的儀器的組成及特點(diǎn)？測(cè)量熒光的儀器的組成及特點(diǎn)？ 熒光分析法48熒光分析法4949光譜分析法光譜分析法吸收光譜法吸收光譜法發(fā)射光譜法發(fā)射光譜法原子光譜法原子光譜法分子光譜法分子光譜法原原子子發(fā)發(fā)射射原原子子吸吸收收原原子子熒熒光光X射射線線熒熒光光原原子子吸吸收收紫紫外外可可見(jiàn)見(jiàn)紅紅外外可可見(jiàn)見(jiàn)核核磁磁共共振振紫紫外外可可見(jiàn)見(jiàn)紅紅外外可可見(jiàn)見(jiàn)分分子子熒熒光光分分子子磷磷光光核核磁磁共共振振化化學(xué)學(xué)發(fā)發(fā)光光原原子子發(fā)發(fā)射射原原子子熒熒光光分分子子熒熒光光分分子子磷磷光光X射射線線熒熒光光化化學(xué)學(xué)發(fā)發(fā)光光熒光分析法50光柵分光光柵分光系統(tǒng)系統(tǒng)熒光分析法51光譜類(lèi)型躍遷類(lèi)型吸收曲線儀器特點(diǎn)主要用途紫外-可見(jiàn)分子吸收-*n-*-A定量定性紅外分子吸收振