重組人錳超氧化物歧化酶的抗腫瘤作用研究分享

1、真誠(chéng)為您提供優(yōu)質(zhì)參考資料，若有不當(dāng)之處，請(qǐng)指正。重組人錳超氧化物歧化酶的抗腫瘤作用研究陳車生1，龐懷宇2，李素霞2，袁勤生2*1上海富海科申藥業(yè)有限公司，2華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237摘要：論文主要研究了rhMnSOD的體內(nèi)抗腫瘤作用、對(duì)荷瘤小鼠的體內(nèi)單獨(dú)使用的抗腫瘤作用、與化療藥物合用的抗腫瘤作用以及抗腫瘤作用機(jī)制探討。關(guān)鍵詞：重組人錳超氧化物歧化酶，抗腫瘤，化療藥物，荷瘤小鼠前言 MnSOD是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一線抗氧化酶，其在體內(nèi)的生理代謝過程中不僅是一個(gè)氧化還原調(diào)節(jié)劑，其還是一個(gè)腫瘤抑制子。已經(jīng)在黑色素瘤、乳腺癌等多個(gè)腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)，通過cDNA轉(zhuǎn)染使得腫瘤細(xì)胞中MnSOD過

2、表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的惡性表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，腫瘤細(xì)胞分化增加。而rhMnSOD的作用機(jī)制可能與其他抗腫瘤藥物作用有所不同，因?yàn)榈侥壳盀橹梗瑳]有研究證據(jù)證明MnSOD具有有細(xì)胞毒作用，因此其抗腫瘤作用應(yīng)該是間接的。我們對(duì)此進(jìn)行了研究。最近有報(bào)道給予小鼠服用rh MnSOD后產(chǎn)生積極的抗氧化作用，并且增加小鼠的體液免疫能力。因此，很可能給予rh MnSOD治療能夠保護(hù)小鼠的免疫系統(tǒng)免受自由基的氧化損傷，同時(shí)能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞募集進(jìn)入腫瘤組織殺死腫瘤細(xì)胞，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。對(duì)于rhMnSOD的抗腫瘤作用還需要在更多種類的腫瘤中進(jìn)行驗(yàn)證，也需要檢測(cè)其與更多的化療藥物的協(xié)同作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行更為深入的

3、研究。根據(jù)目前已經(jīng)發(fā)表的結(jié)果我們可以預(yù)期rhMnSOD和ADR合用能夠降低ADR的心臟毒性等副反應(yīng)，因此，作為抗腫瘤的輔助治療藥物，rhMnSOD具有很大的開發(fā)潛力。1 材料RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司；小牛血清，杭州四季青物工程公司；MTT，美國(guó)Sigma公司；PI/RNase Staining Buffer ，美國(guó)Becton Dickinson公司；AnnexinV-EGFP雙染試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；注射用鹽酸阿霉素，10 mg/瓶，批號(hào)：060705浙江海正藥業(yè)股份有限公司；注射用環(huán)磷酰胺，200 mg/瓶，批號(hào)：06060121江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司

4、；羊抗人CD4多克隆抗體、兔抗人CD8多克隆抗體，羊抗人肌動(dòng)蛋白多克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz 公司；IRDyeTM800結(jié)合二抗，美國(guó)Rockland Inc；SP試劑盒、DAB顯色劑 ， 北京中杉金橋公司。動(dòng)物：ICR清潔級(jí)小鼠，18-22g，雌雄各半，由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物室提供；2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 rhMn-SOD單用及與環(huán)磷酰胺（CTX）、阿霉素（ADR）合用對(duì)小鼠移植瘤EAC的抑制作用按全國(guó)抗癌藥物篩選規(guī)程及新藥臨床前研究指導(dǎo)原則，選取健康且腫瘤生長(zhǎng)旺盛（無壞死）EAC荷瘤小鼠拉斷頸椎處死，經(jīng)消毒后置于超凈臺(tái)中，在無菌條件下取出腫瘤組織，剪碎，加入生理鹽水在研磨器中研磨制成細(xì)胞懸

5、液，計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，將瘤細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)成1×108/ml備用。取ICR小鼠90只，按移植性腫瘤研究法，接種EAC實(shí)體型瘤，每只小鼠右前肢腋窩皮下接種0.2 ml。接種后24 h稱鼠重，并隨機(jī)分為9組，每組10只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)設(shè)：對(duì)照組(0.2 ml生理鹽水)，rhMnSOD 2個(gè)劑量組（7500、15000 U/kg rhMnSOD），ADR組（2 mg/kg ADR），ADR聯(lián)合用藥2個(gè)劑量組（上述rhMnSOD劑量分別與ADR 2 mg/kg聯(lián)用），CTX組（10 mg/kg CTX），CTX聯(lián)合用藥2個(gè)劑量組（上述rhMnSOD劑量分別與CTX 10 mg/kg聯(lián)用）。ADR和C

6、TX用0.2 ml生理鹽水溶解，經(jīng)小鼠尾靜脈給藥，rhMnSOD用生理鹽水稀釋后腹腔注射，在聯(lián)合用藥組中，ADR和CTX給藥后6 h腹腔注射rhMnSOD。于接種后24 h給藥，每天1次，連續(xù)6次。停藥后第2天處死并稱重荷瘤小鼠，分離瘤塊稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。2.2 rhMnSOD單用及與CTX合用對(duì)小鼠移植瘤S180的抑制作用實(shí)驗(yàn)方法同上，實(shí)驗(yàn)設(shè)：對(duì)照組(0.2 ml生理鹽水)，rhMnSOD為5個(gè)劑量組（1000、3000、9000、15000、30000 U/kg rhMnSOD），CTX組（10 mg/kg CTX），CTX聯(lián)合用藥5個(gè)劑量組（上述rhMnSOD劑量分別與CTX 10 m

7、g/kg聯(lián)用）。CTX用0.2 ml生理鹽水溶解，經(jīng)小鼠尾靜脈給藥，rhMnSOD用生理鹽水稀釋后腹腔注射，在聯(lián)合用藥組中，CTX給藥后6 h腹腔注射rhMnSOD。于接種后24 h給藥，每天1次，連續(xù)6次。停藥后第2天處死并稱重荷瘤小鼠，分離瘤塊稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。2.3 rhMnSOD與ADR合用的抗腫瘤作用2.3.1 rhMnSOD與ADR合用對(duì)小鼠移植瘤S180的抑制作用取ICR小鼠100只，按移植性腫瘤研究法，接種S180實(shí)體瘤，接種24 h后稱鼠重，并隨機(jī)分為10組，每組10只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)設(shè)：對(duì)照組(0.2 ml生理鹽水)，ADR組（2 mg/kg ADR），rhMnSOD為4

8、個(gè)劑量組（7500、15000、30000、60000 U/kg rhMnSOD），ADR聯(lián)合用藥4個(gè)劑量組(上述rhMnSOD劑量分別與ADR 2 mg/kg聯(lián)用)。ADR經(jīng)小鼠尾靜脈給藥，rhMnSOD用生理鹽水稀釋后尾靜脈注射，在聯(lián)合用藥組中，ADR給藥后6 h給予rhMnSOD。于接種后24 h給藥，每天1次，連續(xù)6次。停藥后第2天由小鼠眼眶靜脈取血，鏡檢外周血白細(xì)胞總數(shù)，然后處死并稱重荷瘤小鼠，分離瘤塊稱瘤重，計(jì)算抑瘤率與增效率。抑瘤率和增效率按照下式計(jì)算：抑瘤率（1給藥組平均瘤重/空白對(duì)照組平均瘤重）×100%增效率（1聯(lián)合給藥組抑瘤率/陽性對(duì)照組抑瘤率）×10

9、0%2.3.2組織病理學(xué)檢查上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠取出移植瘤，每組隨機(jī)選取3個(gè)瘤塊。瘤塊經(jīng)10%甲醛溶液固定12 h-24 h，常規(guī)取材，梯度乙醇和二甲苯脫水，石蠟包埋，制片（4 m厚），蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色后作病理檢查，根據(jù)病變輕重程度不同，依次標(biāo)記為“-”、“+”、“+”、“+”、“+”表示，其中“-”為無明顯改變，“+”為嚴(yán)重的病理改變。2.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢查每組隨機(jī)選取6個(gè)石蠟包埋的組織切片于系列二甲苯中浸泡脫蠟后， 免疫組織化學(xué)染色檢查。結(jié)果判斷：觀察CD4、CD8表達(dá)已出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。2.3.4 W

10、estern Blot分析小鼠處死取出移植瘤，每組隨機(jī)選取三個(gè)瘤塊，用眼科剪剪為1 mm3左右組織塊。勻漿后離心收集上清液，測(cè)定蛋白含量，SDS-PAGE及蛋白電轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)后的硝酸纖維素膜免疫雜交檢測(cè)靶蛋白。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析3.1 rhMn-SOD單用及與環(huán)磷酰胺（CTX）、阿霉素（ADR）合用對(duì)小鼠移植瘤EAC的抑制作用與對(duì)照相比，所有用藥組對(duì)EAC腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。單用rhMnSOD對(duì)EAC腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且抑制作用隨rhMnSOD劑量的增加而增強(qiáng)。與CTX組相比，rhMnSOD兩個(gè)劑量與CTX合用均沒有增效作用。rhMnSOD與ADR合用有增效作用，與ADR

11、組相比，15000U/kg rhMnSOD劑量的聯(lián)合用藥組的增效作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)期間所有的動(dòng)物存活且無明顯行為異常。3.2 rhMnSOD單用及與CTX合用對(duì)小鼠移植瘤S180的抑制作用與對(duì)照相比，所有用藥組對(duì)S180腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。單用rhMnSOD對(duì)S180腫瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且抑制作用隨rhMnSOD劑量的增加而增強(qiáng)。與CTX組相比，rhMnSOD 5個(gè)劑量與CTX合用均沒有增效作用。3.3 rhMnSOD與ADR合用的抗腫瘤作用3.3.1 rhMnSOD與ADR合用對(duì)小鼠移植瘤S180的抑制作用與對(duì)照相比，rhMnSOD對(duì)S180腫

12、瘤的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且抑制作用隨rhMnSOD劑量的增加而增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)期間所有的小鼠均存活切無行為異常，給藥組和對(duì)照組相比，體重和白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果均無明顯差異。與對(duì)照組相比，所有聯(lián)合用藥組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)都具有顯著抑制作用（P<0.01），且抑制作用隨rhMnSOD劑量的增加而增強(qiáng)。與ADR組相比，除2 mg/kg rhMnSOD聯(lián)合用藥組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制沒有明顯增效外，其余三個(gè)用藥組均有增效作用，且8 mg/kg和16 mg/kg rhMnSOD劑量的兩個(gè)聯(lián)合用藥組的增效作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。3.3.2 小鼠S180移植瘤的組織病理學(xué)檢查病理學(xué)檢查，對(duì)照組中，腫瘤細(xì)胞分

13、裂增殖旺盛，細(xì)胞密度很高，病理性核分裂經(jīng)?？梢?，腫瘤組織邊緣光滑；而rhMnSOD單用組和聯(lián)合用藥組的腫瘤細(xì)胞分裂增殖被抑制，細(xì)胞密度降低，腫瘤細(xì)胞核物質(zhì)濃縮，部分腫瘤細(xì)胞呈壞死狀，腫瘤組織邊緣有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。這些變化隨rhMnSOD給藥劑量的增加而增強(qiáng)，聯(lián)合用藥組的變化比相同rhMnSOD劑量單用組的變化更明顯。3.3.3 CD4+與CD8+的表達(dá)分析為探討rhMnSOD的抗腫瘤作用機(jī)制，我們根據(jù)組織病理學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)這一現(xiàn)象，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行了免疫組化分析。與對(duì)照組相比，單用rhMnSOD或rhMnSOD與ADR聯(lián)用的荷瘤小鼠的瘤組織邊緣部分可見明顯CD4+、CD8陽性表達(dá)，且有隨

14、著rhMnSOD劑量增加而加強(qiáng)的趨勢(shì)，提示藥物有促進(jìn)淋巴細(xì)胞募集并激活淋巴細(xì)胞的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證這種現(xiàn)象，進(jìn)行了CD4+和CD8+表達(dá)的免疫印跡分析（圖1），結(jié)果表明，隨著rhMnSOD給藥劑量的增加，CD4+與CD8+的表達(dá)確實(shí)呈上調(diào)趨勢(shì)，且與ADR聯(lián)用可加強(qiáng)這種上調(diào)作用，不過與對(duì)照組相比，差異尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Fig.1 Effect of rhMnSOD alone or in combination with ADR on the expression of CD4 and CD8 protein in tumors. Actin was used as a

15、loading control. Representative immunoblots are shown as in (A). Results are expressed as means ± SD (n=3). (B, C)4、結(jié)論與討論在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以看到，單用rhMnSOD能夠顯著抑制EAC和S180腫瘤的生長(zhǎng)，且抑制作用隨rhMnSOD劑量的增加而增強(qiáng)，說明直接使用rhMnSOD可以達(dá)到MnSOD基因治療的類似的抗腫瘤效果，不過兩者的機(jī)制可能有所不同。與化療藥物的協(xié)同作用表明，rhMnSOD與CTX對(duì)EAC和S180腫瘤的抑制均無協(xié)同作用，而與ADR合用，對(duì)兩種腫瘤的抑制均有協(xié)同作用，且對(duì)腫瘤的抑制作用隨rhMnSOD劑量的增加而增強(qiáng)。這種差別可能與兩種藥物自身的作用機(jī)理不同有關(guān)，ADR的作用機(jī)制中涉