高一生物基因工程的基本操作程序人教實(shí)驗(yàn)版

1、高一生物基因工程的基本操作程序人教實(shí)驗(yàn)版【本講教育信息】一. 教學(xué)內(nèi)容：基因工程的基本操作程序二. 學(xué)習(xí)內(nèi)容本節(jié)是基因工程專題的核心，上承DNA重組技術(shù)的基本工具一節(jié)，下接基因工程的應(yīng)用。通過教材上的圖示，理解掌握基因工程的相關(guān)概念和操作程序，理解基因工程操作的意義。三. 教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)1. 教學(xué)重點(diǎn)提取目的基因的方法目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的途徑?；蚬こ袒静僮鞒绦虻乃膫€(gè)步驟。2. 教學(xué)難點(diǎn)從基因文庫(kù)中獲取目的基因。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。四. 教學(xué)過程基因文庫(kù)：用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總 DNA 或染色體DNA的所有片斷隨機(jī)地連接到基因載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞

2、增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無性繁殖系（克?。谥苽涞目寺?shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)：用限制性內(nèi)切酶切割細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA，可以得到大量的基因組DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓宿主菌長(zhǎng)成克隆。這樣，一個(gè)克隆內(nèi)的每個(gè)細(xì)胞的載體上都包含有特定的基因組DNA片段，整個(gè)克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和稱為基因組文庫(kù)。cDNA基因文庫(kù)：cDNA是由細(xì)胞內(nèi)的mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄的方式獲得的，其包含的一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)信息。多細(xì)胞生物的不同細(xì)胞的表達(dá)信息往往是不同的。若將某一個(gè)細(xì)胞全部的mRNA（

3、又稱為這個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組）都逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將這些cDNA連接到載體上（基本上不打斷）并轉(zhuǎn)入微生物，那么這些微生物就組成了cDNA文庫(kù)。cDNA組成特點(diǎn)是其中不含有內(nèi)含子和其他調(diào)控序列。同一定義也適用于某種生物的線粒體DNA或葉綠體DNA的基因文庫(kù)。由于制備DNA片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的 DNA片段既可能是一個(gè)或幾個(gè)基因，也可能是一個(gè)基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近DNA順序?；蛭膸?kù)與基因庫(kù)的概念不同?；驇?kù)是指某一生物群體中的全部基因。基因文庫(kù)與基因克隆的概念也有區(qū)別，基因克隆是只包含某些特定基因或 DNA片段的克隆?；蛭膸?kù)中包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供

4、隨時(shí)選取其中任何一個(gè)基因克隆之用。PCR技術(shù)：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。PCR反應(yīng)的基本成分包括：模板DNA（待擴(kuò)增DNA）、引物、4種脫氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)

5、備； 模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，在溫度降至55左右時(shí)，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； 引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。目的基因：把需要研究的基因稱為目的基因。（一般把需要分析的基因稱靶基因，在基因克隆過程中有時(shí)兩者均稱為插入基因，有時(shí)三者含義相近。）目的基因的制備：1. 從細(xì)胞核中直接分離簡(jiǎn)單的原核生物目的基因可從細(xì)

6、胞核中直接分離得到，但人類的基因分布在23對(duì)染色體上，較難從直接法中得到。2. 染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解II型限制性內(nèi)切酶可專一性地識(shí)別并切割特定的DNA順序，產(chǎn)生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入的DNA片段用同一種內(nèi)切酶消化，或靶DNA與載體DNA末端具有互補(bǔ)的粘性末端，可以直接進(jìn)行連接。3. 人工體外合成 簡(jiǎn)短的目的基因可在了解DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)或多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列的基礎(chǔ)上人工合成。4. 用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA 大多數(shù)的目的基因是由mRNA合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄DNA）得到。從RNA入手，先從細(xì)胞提取總RNA，然后根據(jù)大多數(shù)真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyad

7、enylic acid ,polyA）尾的特點(diǎn)，用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出，以mRNA為模板，在多聚A尾上結(jié)合1218個(gè)dT的寡聚dT片段，作為合適的起始引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第一條目的基因。啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子就像“開關(guān)”，決定基因的活動(dòng)。既然基因是成序列的核苷酸，那么啟動(dòng)子也應(yīng)由DNA組成。啟動(dòng)子本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄因子的這種蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。終止子：DNA分子中終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。而終止密碼子是作為翻譯終止的信號(hào)，在圖中，DNA分子下面一條被從左到右轉(zhuǎn)錄，從畫線DNA轉(zhuǎn)錄來的RN

8、A片段形成發(fā)夾環(huán)，因?yàn)閮煽蛑泻塑账岷谢パa(bǔ)堿基順序，這就迫使DNA/RNA雜交區(qū)域裂開，因?yàn)殡S后包括氫鏈結(jié)合較弱的多聚腺苷酸和尿嘧啶mRNA分子就從這個(gè)位置脫離下來。1. 外顯子與內(nèi)含子一般來說，結(jié)構(gòu)基因都是由外顯子和內(nèi)含子組成，但是，外顯子和內(nèi)含子的關(guān)系不是完全固定不變的。有時(shí)同一條DNA鏈上的某一段DNA序列，當(dāng)它作為編碼某多肽鏈的基因時(shí)是外顯子，而作為編碼另一多肽鏈的基因時(shí)，則是內(nèi)含子，結(jié)果是同一基因可以同時(shí)轉(zhuǎn)錄為兩種或兩種以上的mRNA。2. 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)的異同點(diǎn) 原核細(xì)胞的基因真核細(xì)胞的基因不同點(diǎn)編碼區(qū)連續(xù)；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單編碼區(qū)有間隔，不連續(xù)；結(jié)構(gòu)復(fù)雜相

9、同點(diǎn)都有編碼區(qū)和非編碼區(qū)；編碼區(qū)都有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列；編碼區(qū)上游都有與RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)3. 獲取目的基因的方法3. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（以質(zhì)粒為運(yùn)載體）4. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞：細(xì)菌 氯化鈣細(xì)胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制 【模擬試題】（答題時(shí)間：60分鐘）一. 選擇題1. 構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí)，首先雷分離細(xì)胞的（ ）A. 染色體DNA   B. 線粒體DNA   C. 總mRNA   D. tRNA  2. 在基因工程中，把選出的目的

10、基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460個(gè)）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是（ ）A. 540個(gè) B. 8100個(gè) C. 17280個(gè)D. 7560個(gè)2. 在基因工程中，科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是（ ） A. 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便 B. 遺傳物質(zhì)含量少 C. 繁殖速度快 D. 性狀穩(wěn)定，變異少3. 因工程的操作步驟： 使目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合， 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞， 檢測(cè)目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求， 提取目的基因，正確的操作順序是（ ）A. B. C. D. 4. 工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施

11、工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（ ）A. 人工合成基因 B. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D. 目的基因的檢測(cè)和表達(dá)5. 就分于結(jié)構(gòu)而論，質(zhì)粒是（ ）A. 環(huán)狀雙鏈DNA分子   B. 環(huán)狀單鏈DNA分于C. 環(huán)狀單鏈RNA分子   D. 線狀雙鏈DNA分子6. 聚合酶鏈反應(yīng)可表示為（ ）A. PEC   B. PER   C. PDR   D. PCR7. 在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是（ ）A. 化學(xué)合成法  &#

12、160; B. 基因組文庫(kù)法C. cDNA文庫(kù)法   D. 聚合酶鏈反應(yīng)8. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是（ ）A. 限制性內(nèi)切酶只在獲得目的基因時(shí)才用B. 重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C. 質(zhì)粒都可作運(yùn)載體D. 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料9. 不屬于目的基因與運(yùn)載體結(jié)合過程的是（ ）A. 用一定的限制酶切割質(zhì)粒露出黏性末端B. 用同種限制酶切割目的基因露出黏性末端C. 將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增D. 將切下的目的基因插入到質(zhì)粒切口處10. 科學(xué)家通過基因工程的方法，能使馬鈴薯塊莖含有人奶蛋白。以下有關(guān)該基因工程的敘述錯(cuò)誤的是（ ）A. 采用反轉(zhuǎn)錄的方法得到的

13、目的基因B. 基因非編碼區(qū)對(duì)于目的基因在塊莖中的表達(dá)是不可缺少的C. 馬鈴薯的葉肉細(xì)胞可作為受體細(xì)胞D. 用不同種限制酶處理質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，可產(chǎn)生黏性末端而形成重組DNA分子11. 基因工程常用的受體細(xì)胞有（ ） 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動(dòng)植物細(xì)胞A. B. C. D. 12. 用DNA探針檢測(cè)飲用水中病毒的具體方法是（ ）A. 與被檢測(cè)病毒的DNA堿基序列進(jìn)行比較B. 與被檢測(cè)病毒的DNA堿基序列進(jìn)行組合C. 與被檢測(cè)病毒的DNA堿基序列進(jìn)行雜交D. A、B、C三種方法均可13. 1976年，美國(guó)的H.Boyer教授首次將人的生長(zhǎng)抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌，并獲得表達(dá)

14、，此文中的“表達(dá)”是指該基因在大腸桿菌（ ） A. 能進(jìn)行DNA復(fù)制 B. 能傳遞給細(xì)菌后代C. 能合成生長(zhǎng)抑制素釋放因子 D. 能合成人的生長(zhǎng)素14. 在遺傳工程技術(shù)中，限制性內(nèi)切酶主要用于（ ）A. 目的基因的提取和導(dǎo)入B. 目的基因的導(dǎo)入和檢測(cè)C. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合和導(dǎo)入D. 目的基因的提取和與運(yùn)載體結(jié)合15. （05廣東）以下有關(guān)基因工程的敘述，正確的是（ ）A. 基因工程是細(xì)胞水平上的生物工程 B. 基因工程的產(chǎn)物對(duì)人類全部是有益的C. 基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變 D. 基因工程育種的優(yōu)點(diǎn)之一是目的性強(qiáng)16.（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括（ ）A. 目的基因 B. 啟動(dòng)

15、子 C. 終止子 D. 標(biāo)記基因二. 非選擇題：1 在藥品生產(chǎn)中，有些藥品如干擾素，白細(xì)胞介素，凝血因子等，以前主要是從生物體的組織、細(xì)胞或血液中提取的，由于受原料來源限制，價(jià)價(jià)十分昂貴，而且產(chǎn)量低，臨床供應(yīng)明顯不足。自70年代遺傳工程發(fā)展起來以后，人們逐步地在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的目的基因，使之與質(zhì)粒形成重組DNA，并以重組DNA引入大腸桿菌，最后利用這些工程菌，可以高效率地生產(chǎn)出上述各種高質(zhì)量低成本的藥品，請(qǐng)分析回答：（1）在基因工程中，質(zhì)粒是一種最常用的 ，它廣泛地存在于細(xì)菌細(xì)胞中，是一種很小的環(huán)狀 分子。（2）在用目的基因與質(zhì)粒形成重組DNA過程中，一般要用到的工具酶是 和 。（3）將含有

16、“某激素基因”的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞后，能在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)直接合成“某激素”，則該激素在細(xì)菌體內(nèi)的合成包括 和 兩個(gè)階段。（4）在將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌時(shí)，一般要用 處理細(xì)菌，以增大 。2. 下圖是將人類的生長(zhǎng)激素基因?qū)爰?xì)菌B細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”的示意圖，所用的載體為質(zhì)粒A。已知細(xì)菌B細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因，質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌B后，其上的基因能得到表達(dá)。請(qǐng)回答下列問題：（注：質(zhì)粒中的a點(diǎn)即是四環(huán)素抗性基因的存在位置，又是與目的基因的結(jié)合點(diǎn)；斜線部分為抗氨芐青霉素基因）（1）人工合成目的基因的途徑一般有哪兩條？（2）如何將目的基因和質(zhì)粒結(jié)合成重組質(zhì)粒？（3）目前把重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，效率還不高，

17、導(dǎo)入完成后得到的細(xì)菌，實(shí)際上有的根本沒有導(dǎo)入質(zhì)粒，有的導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒A，只有極少數(shù)導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒。可通過以下步驟鑒別得到的細(xì)菌是否導(dǎo)入了質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒；將得到的細(xì)菌涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)的就是導(dǎo)入了質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒的細(xì)菌，反之則沒導(dǎo)入。使用這種方法鑒別的原因是什么？（4）若把通過鑒定證明導(dǎo)入了普通質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒的細(xì)菌放在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)生的現(xiàn)象是什么？（5）導(dǎo)入細(xì)菌B細(xì)胞的目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是什么？3. 科學(xué)家通過基因工程培育抗蟲棉時(shí)，需要從蘇云金芽孢桿菌中提取出抗蟲基因，“放入”棉花的細(xì)胞中與棉花的DNA結(jié)合起來并發(fā)揮作用，請(qǐng)回答下列有關(guān)問題：（

18、1）從蘇云金芽孢桿菌中切割抗蟲基因所用的工具是，此工具主要存在于中，其特點(diǎn)是。（2）蘇云金芽孢稈菌一個(gè)DNA分子上有許多基因，獲得抗蟲基因常采用的方法是“鳥槍法”。具體做法是：用酶將蘇云金芽孢桿菌的切成許多片段，然后將這些片段，再通過  轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓它們?cè)诟鱾€(gè)受體細(xì)胞中大量，從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再用一定的方法把分離出來。（3）進(jìn)行基因操作一般要經(jīng)過的四個(gè)步驟是 、 、 、 ?！驹囶}答案】一. 選擇題：1. A 2. C 3. C 4. C 5. A 6. D 7. D 8. D 9. C 10. D11. D 12. C 13. C 14. D 15. D16. A

19、BCD二. 非選擇題：1. （1）基因的運(yùn)載體 DNA （2）限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 （3） 轉(zhuǎn)錄 翻譯（4） 氯化鈣 細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性 2. 解析：此題是對(duì)基因操作“四步曲”比較全面的考查，而且注意聯(lián)系實(shí)際。（1）據(jù)課本內(nèi)容知人工合成基因的兩條途徑是： 將從細(xì)胞中提取分離出的目的基因作為模板，轉(zhuǎn)錄成mRNA單鏈DNA雙鏈DNA； 據(jù)蛋白質(zhì)中氨基酸序列mRNA中堿基序列DNA堿基序列目的基因。（2）將目的基因和質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒的過程是： 用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)有粘性末端的切口； 用同種限制酶切割目的基因，產(chǎn)生相同的粘性末端； 將切下的目的基因片段插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，使質(zhì)粒與目的基因結(jié)合成重組質(zhì)粒。（3）檢測(cè)質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，均需利用質(zhì)粒上某些標(biāo)記基因的特性。即對(duì)已經(jīng)做了導(dǎo)入處理的、本身無相應(yīng)特性的受體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)受體細(xì)胞是否具有相應(yīng)的特性來確定。抗氨芐青霉素基因在質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒上，且它與目的基因是否插入無關(guān)，所以，用含氨芐青霉素這種選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)粒處理的受體細(xì)胞，凡能生長(zhǎng)的則表明質(zhì)粒