復(fù)方伊維菌素和吡喹酮注射液的研制

1、70中國(guó)獸醫(yī)雜志2010年(第46卷)第3期ChineseJournalofVeterinaryMedicine復(fù)方伊維菌素和吡喹酮注射液的研制牛麗娟1,湯樹生1,郭召旭1,陳琳琳1,趙婷婷1,聶嚴(yán)2,萬(wàn)仁玲2,肖希龍1(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193;2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京海淀100081)中圖分類號(hào):S859.79+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):052926005(2010)0320070202近年來(lái),由于線蟲、絳蟲、吸蟲以及體外寄生蟲收稿日期:2009202222基金項(xiàng)目:“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“獸用復(fù)方新制劑(2006BAD31B08)的研制與應(yīng)用”作者簡(jiǎn)介

2、:牛麗娟(19822),女,碩士,從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究,E2mail:mingtian0505_1982通訊作者:肖希龍,電話:010262733377;E123,使獸醫(yī)臨型復(fù)方制劑,的相同;微隆起、表面光滑、半透明,菌落呈淺綠色,鮮血培養(yǎng)基為型溶血。3.3動(dòng)物試驗(yàn)4個(gè)試驗(yàn)組8只小鼠均在1224h內(nèi)死亡,剖檢死亡小鼠,臟器分別涂片,經(jīng)革蘭染色鏡檢,可見與注射培養(yǎng)物相同的細(xì)菌,對(duì)照小鼠沒(méi)有死亡。3.4生化試驗(yàn)對(duì)分離到的4株細(xì)菌的培養(yǎng)物分試驗(yàn)項(xiàng)目2和4號(hào)菌株1號(hào)菌株別做氧化酶測(cè)定試驗(yàn),結(jié)果2號(hào)菌株和4號(hào)菌株呈陰性,將其接種于細(xì)菌自動(dòng)鑒定ID32E試條上,1號(hào)菌株和3號(hào)菌株呈陽(yáng)性將其接種于細(xì)菌自動(dòng)鑒定

3、ID32NG試條上,37培養(yǎng)24h。細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀讀出2號(hào)和4號(hào)為大腸埃希氏菌,1號(hào)為嗜水/豚鼠氣單胞菌,3號(hào)為熒光假單胞菌,它們主要的生化試驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果如表1。表1生化試驗(yàn)結(jié)果甘露醇+麥芽糖+鼠李糖+-葡萄糖+L2阿拉伯糖+-山梨醇+-蔗糖-+肌醇-吲哚產(chǎn)生-水楊素+糖原+3.5血清型鑒定大腸桿菌用腸道致病性埃希氏菌診斷血清,2號(hào)菌株和4號(hào)菌株的血清型均為02。3.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)第一批病料痢特靈、新霉素效果好,對(duì)第二批病料阿米卡星、新霉素、氧哌嗪青霉素、頭孢哌酮鈉(先鋒必)效果好,其他藥物效果不明顯。4討論4.1Popoff等(1981)根據(jù)有動(dòng)力氣單胞菌之間的表型和遺傳關(guān)系將本群氣單胞菌分

4、為嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和溫和氣單胞菌3個(gè)種,嗜水氣單胞菌是條件性致病菌,在淡水、海水及浮游生物中普遍存在,一旦環(huán)境被污染,水生動(dòng)物抵抗力降低,就會(huì)暴發(fā)本病,稱為有動(dòng)力氣單胞菌敗血癥。熒光假單胞菌是草魚等魚類的假單胞菌敗血癥或出血性敗血癥的病原菌,在我國(guó)流行較廣,在放養(yǎng)、扦捕或凍傷后易感染此菌。大腸桿菌系人和溫血?jiǎng)游锬c道后段正常菌群的主要成員之一。是條件性致病菌,并從糞便散播至周圍環(huán)境。兩批病料雖感染不同的水生動(dòng)物傳染性疾病,但同時(shí)都感染大腸桿菌。這可能是給海豹飼喂了被這些細(xì)菌污染的食物,加之飼養(yǎng)管理跟不上,水源造成污染,使海豹感染上述細(xì)菌。另一個(gè)可能是海水的配制有問(wèn)題,水的酸堿度(pH)

5、及鹽度沒(méi)有達(dá)到要求,使海豹的免疫抵抗力下降,而感染疾病。4.2由于治療嗜水氣單胞菌病和熒光假單胞菌病的主要治療藥物為呋喃唑酮,而大腸桿菌對(duì)多數(shù)藥物有較強(qiáng)的耐藥性,本實(shí)驗(yàn)室的藥敏結(jié)果是上述菌株對(duì)痢特靈、新霉素、阿米卡星、氧哌嗪青霉素、頭孢哌酮鈉(先鋒必)效果好,其他藥物效果不明顯,娛樂(lè)場(chǎng)飼養(yǎng)人員只是盲目的根據(jù)海豹提供主的要求用慶大霉素進(jìn)行治療,使得海豹的病情加劇。因此,最好根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用敏感的抗菌藥物進(jìn)行治療,避免同一藥物連續(xù)使用,方可避免一些不必要的損失。參考文獻(xiàn):1楊本升,劉玉斌,茍仕金,等.動(dòng)物微生物學(xué)M.長(zhǎng)春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1995:5.2王世若.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)M.長(zhǎng)春

6、:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1990:8.3白文彬,于康震.動(dòng)物傳染病診斷學(xué)M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2002:12.4費(fèi)恩閣.動(dòng)物傳染病學(xué)M.長(zhǎng)春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1995:8.ChineseJournalofVeterinaryMedicine中國(guó)獸醫(yī)雜志2010年(第46卷)第3期71睫。本文的研究目的是以當(dāng)前獸醫(yī)臨床常用的伊維菌素(主治線蟲和體外寄生蟲)和吡喹酮(主治絳蟲和吸蟲)為主要原料,研制伊維菌素和吡喹酮的復(fù)方注射液,為我國(guó)獸醫(yī)臨床提供一種使用方便且對(duì)動(dòng)物寄生蟲混合感染具有較好療效的抗寄生蟲復(fù)方制劑。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料伊維菌素(96.2%)和吡喹酮(99.6%)原藥系浙江海

7、正藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng);伊維菌素對(duì)照品(94%,Sigma公司);吡喹酮對(duì)照品(99.5%),中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。1.2復(fù)方注射劑的研制從多種有機(jī)溶劑中篩選出對(duì)伊維菌素和吡喹酮均有較好溶解性能,系;1.3最佳用量,、中3個(gè)水平按正交表L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)因素水平見表1。表1正交試驗(yàn)因素水平因素水平123試驗(yàn)因素抗氧化劑(%)0.20.51.0止痛劑(%)0.50.91.21.4伊維菌素含量檢測(cè)方法1.4.1色譜條件紫外檢測(cè)器;色譜柱(SHIMAD2ZUUP2ODS,5m,150×4.6mm);流動(dòng)相:乙射液(不含伊維菌素和吡喹酮的空白制劑)中添加伊維菌素和吡喹酮至配方濃

8、度。1.7樣品前處理制劑樣品和添加樣品的前處理方法相同,具體步驟如下:將樣品搖勻,用移液管取出2mL樣品于25mL容量瓶?jī)?nèi),用甲醇溶解,定容,微孔濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣。1.8穩(wěn)定性試驗(yàn)1.8.1光加速試驗(yàn)取復(fù)方注射液3批樣品,置照度為4500±500Lx10d,分別于5d、10d,、含量、澄明度1.8.3,在溫度%±5%的條件放置6個(gè)1次,考察樣品外觀色澤、含量、澄明、降解產(chǎn)物、不溶性微粒等指標(biāo)。2結(jié)果與分析2.1復(fù)方注射液的研制2.1.1溶劑體系篩選結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果顯示,吡喹酮在丙二醇、吡咯烷酮、二甲基甲酰胺等溶劑中溶解度較高,但吡喹酮經(jīng)吡咯烷酮溶解后易出現(xiàn)變色反應(yīng);伊維菌素在有機(jī)

9、溶劑中極易溶解,但用聚乙二醇、無(wú)水乙醇、甘油等溶解后易出現(xiàn)結(jié)晶或雪花狀沉淀。經(jīng)反復(fù)多次篩選,最終確定丙二醇和二甲基乙酰胺按適宜比例的混合溶劑體系可達(dá)到較理想的溶解效果。2.1.2助劑篩選結(jié)果篩選結(jié)果表明,本制劑的適宜抗氧化劑和止痛劑分別為二叔丁基羥基甲苯和利多卡因。若選用叔丁基羥基茴香醚為抗氧劑,所制得樣品易出現(xiàn)變粉現(xiàn)象,而用生育酚為抗氧化劑則因其出峰時(shí)間與吡喹酮出峰時(shí)間有重疊,分離效果差。利多卡因被選為本制劑的最終止痛劑的優(yōu)勢(shì)是刺激性較小且溶解性能極好,同時(shí)不影響吡喹酮的分離效果。2.1.3正交試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用最大極差法處理,結(jié)果顯示,最佳配方組合是抗氧化劑為0.2%、止痛劑為0.9%的配方。

10、從兩者的極差值(R值)可知,抗氧化劑(R=0.49)和止痛劑(R=0.41)對(duì)制劑質(zhì)量的影響差別不大,但抗氧化劑的水平對(duì)制劑質(zhì)量的影響稍大些。2.2制劑藥物含量檢測(cè)方法制劑中伊維菌素和吡喹酮的含量檢測(cè)方法在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系,線性方程分別為Y=26609.64X+75675.17(r=0.9999)和Y=829000X+16500(r=0.9998)。3批伊維菌素添加樣的回收率分別為89.1%、93.6%、102.4%,變異系數(shù)為3.5%;3腈甲醇水(533512);流速:1.5mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):245nm;進(jìn)樣量:20L。1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作精密稱量伊維菌素對(duì)照品用甲

11、醇溶解并定容成880g/mL儲(chǔ)備液,倍比稀釋后得標(biāo)準(zhǔn)工作液(27.5880g/mL)進(jìn)HPLC測(cè)定,以峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5吡喹酮含量檢測(cè)方法1.5.1色譜條件紫外檢測(cè)器;色譜柱:IntertsilC18柱(5m,250×4.6mm,DIKMA公司);流動(dòng)相:甲醇水(973);流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):263nm;進(jìn)樣量:10L。1.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作精密稱量吡喹酮對(duì)照品用甲醇溶解并定容成為5.9mg/mL儲(chǔ)備液,稀釋后得標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.1185.9g/mL)進(jìn)HPLC測(cè)定,以峰面積對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.6回收率試驗(yàn)配方中伊維菌素和吡喹酮含量分別為0.25%和6

12、%,回收率試驗(yàn)時(shí)分別在空白注72中國(guó)獸醫(yī)雜志2010年(第46卷)第3期ChineseJournalofVeterinaryMedicine批吡喹酮添加樣的回收率分別為95.2%、99.3%、103.3%,變異系數(shù)為4.1%。2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果2.3.1光加速試驗(yàn)結(jié)果光加速試驗(yàn)結(jié)果見表2,在強(qiáng)光照射前三批復(fù)方注射液均為無(wú)色澄明液體,經(jīng)強(qiáng)光照射10d,樣品的澄明度無(wú)明顯變化,但3批樣品的色澤在第5天時(shí)變?yōu)榈S色,至第10天時(shí)3批樣品均變?yōu)樯铧S色。制劑中的藥物含量亦有部分下降,但仍在規(guī)定范圍內(nèi),其中伊維菌素和吡喹酮的含量下降范圍分別在3.6%和2.9%之內(nèi)。表2復(fù)方注射液光加速試驗(yàn)結(jié)果(實(shí)測(cè)量/

13、標(biāo)示量,%)批次(d)0510080911IVM100.199.396.4PZQ99.497.497.5080925IVM101.2100.0PZQ99.297.1080926IVM100.4PZQ298.332.3.2表3,3批復(fù)方注射液均為無(wú)色澄明液體,外觀色澤和澄明度均無(wú)明顯變化。雖然制劑中藥物含量有所下降,但均在允許范圍內(nèi),其中伊維菌素和吡喹酮的下降范圍分別為5.2%和3.2%之內(nèi)。表3復(fù)方注射液溫濕加速試驗(yàn)結(jié)果(實(shí)測(cè)量/標(biāo)示量,%)批次(月)0123456080911IVM100.199.898.597.696.795.894.8PZQ99.499.399.198.898.597.8

14、97.1080925IVM101.2102.2101.2100.399.398.697.9PZQ99.2100.2101.1100.6100.199.298.2080926IVM100.6102.8102.9100.798.597.696.7PZQ100.3100.5100.7100.6100.598.796.8早526,因此建立制劑中藥物含量檢測(cè)方法的難點(diǎn)在于如何將伊維菌素和吡喹酮與制劑中輔料成分成功(2005年分離。本文以中華人民共和國(guó)獸藥典版)為基礎(chǔ),查閱國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)528后成功建立了制劑中伊維菌素和吡喹酮含量的HPLC檢測(cè)方法。本文建立的方法具有如下優(yōu)點(diǎn):樣品前處理方法簡(jiǎn)單,且樣品處理

15、后48h內(nèi)仍具有極好的穩(wěn)定性;分析時(shí)間短(每個(gè)樣品都可以在20min之內(nèi)完成分析)。,本制劑在強(qiáng)光照射第5,雖然制劑澄明度無(wú)明顯變化,圍內(nèi),但為保證產(chǎn)品質(zhì)量,本制劑宜避光保存。溫濕加速試驗(yàn)顯示,本制劑在溫度40±2,相對(duì)濕度75%±5%條件下放置6個(gè)月后其外觀色澤和澄明度均無(wú)明顯變化。雖然制劑中藥物含量有所下降,但均在允許范圍內(nèi),結(jié)果表明,制劑在恒溫恒濕條件下放置6個(gè)月穩(wěn)定性良好。目前長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)正在進(jìn)行中,制劑的有效期最終將結(jié)合濕溫加速試驗(yàn)結(jié)果和長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果確定。參考文獻(xiàn):1惠禹,王珂玉.張家川縣人畜共患寄生蟲調(diào)查J.中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病,2001,1:1442146

16、.2張海英,劉世輝,趙豐文.民和縣黃牛內(nèi)寄生蟲感染情況調(diào)查J.青海畜牧獸醫(yī)雜志,2007,4:28.3李永剛,包彩玲,靳兆江.齊齊哈爾市綿羊寄生蟲病流行因素分析與防治措施J.中國(guó)獸醫(yī)寄生蟲病,2005,4:1402141.4于詠蘭.寵物用復(fù)方驅(qū)蟲劑的研制D.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.5HanpitakpongW,BanmairuroiV,KamanikomB,etal.Ahigh2performanceliquidchromatographicmethodfordetermi2nationofpraziquantelinplasmaJ.JPharmBioMedAna1,2004,36:87

17、12874.6DirkS,GottfriedB.Isolationandidentificationof82hydroxy2praziquantelasametaboliteoftheantischistosomaldrugpraz2iquantelJ.JPharmBioMedAna1,2001,26:7912799.7AndreasMA,LeChung,DavidGM.Developmentandvali2dationofanautomatedextractionmethod(acceleratedsolventextraction?)andareverse2phaseHPLCanalysismethodforassayofivermectininameat2basedchewableformulationJ.JPharmBioMedAna1,2003,31:117721183.8LifschitzA.Pharmacokineticevaluationoffourivermectinge2nericformulationsincalvesJ.VetP