中藥化學(xué)成分的分離方法ppt課件

1、第三節(jié)中藥化學(xué)成分的分離方法 中藥化學(xué)成分經(jīng)提取濃縮后，得到的仍是含有多種成分的混合物，需選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑵渲兴鞣N成分逐一分開，并把所得單體加以精制純化，這一過程稱為分離。 一、兩相溶劑萃取法兩相溶劑萃取法簡稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種不相混溶的溶劑中分配系數(shù)的不同達到分離的方法。分配系數(shù)是指在一定溫度時，一種物質(zhì)溶解在相互接觸但不混溶的兩相溶劑中，溶解平衡后，兩溶劑中溶質(zhì)濃度的比值。此比值在一定的溫度及壓力下為一常數(shù)，可以用下式表示： 分配系數(shù) CH物質(zhì)在上層溶劑中的濃度 CL物質(zhì)在下層溶劑中的濃度混合物中各成分在兩相溶劑中，分配系數(shù)相差越大，分離效果越好。 CHCL=K （一簡

2、單萃取法 是分離物質(zhì)最簡單最基礎(chǔ)的手段，常用于初步分離。 （二逆流連續(xù)萃取法 是一種兩相溶劑逆行的連續(xù)萃取方法。其裝置如圖2-5 （三逆流分溶法Counter Current Distribution，CCD） 對性質(zhì)相似的異構(gòu)體或同系物，因在兩相溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)接近，用一般的萃取及轉(zhuǎn)移操作常須進行幾十次乃至幾百次，簡單的分次萃取已不能滿足需要，用逆流分溶法可得到理想的分離效果。 逆流分溶法又稱逆流分配法、逆流分布法或反流分布法。是一種將液-液萃取反復(fù)進行數(shù)十次以上的分離方法。如圖2-6所示 逆流分溶法因操作條件溫和、試樣易回收，故特別適合于中等極性、不穩(wěn)定、性質(zhì)相似成分的分離。另外，溶質(zhì)

3、濃度越低，分離效果越好。但試樣極性過大或過小，或分配系數(shù)受濃度或溫度影響過大時，則不易采用此法分離。易于乳化的萃取溶劑系統(tǒng)也不易采用此法。 （四液滴逆流分配法Droplet Counter Current Chromatography，DCCC） 這是在逆流分溶法基礎(chǔ)上改進發(fā)展起來的一種高分離效能的兩相溶劑萃取法。利用混合物中各成分在兩液相間分配系數(shù)的差別，由流動相形成液滴，通過作為固定相的液體柱而達到分離純化的目的。其裝置示意圖見2-7 影響液滴逆流分配的主要因素有：被分離成分在兩相溶劑間的分配系數(shù)要大；形成大小合適的移動相液滴，這與兩相間的界面張力、密度差、輸液管口徑和萃取管材料等有關(guān)，可

4、以采用數(shù)根萃取管預(yù)試液滴的形成情況而確定；液滴間的間隔，與泵的送液速度有關(guān)，送液速度過快，液滴間幾無間隔變成線流通過固定相，通常也可經(jīng)過小樣探索而定。 液滴逆流分配法的分離效果往往比逆流分溶法好，且不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。移動相用氮氣驅(qū)動，被分離物質(zhì)不會因遇空氣中氧而氧化。應(yīng)用該法曾滿意地分離純化多種成分，如皂苷、生物堿、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及糖類等。 二、超臨界流體萃取法 超臨界流體萃取法Supercritical Fluid Extraction， SFE是以超臨界流體簡稱SF代替常規(guī)有機溶劑進行提取、分離的一種新型方法。1超臨界流體的特性與種類 超臨界流體是指物質(zhì)在高于其臨界溫度TC和臨界壓力

5、PC時所形成的單一相態(tài)。處于超臨界狀態(tài)的物質(zhì)既不是液體，也不是氣體，理化性質(zhì)介于液體和氣體之間，其特性表現(xiàn)為：超臨界流體的密度比氣體大，而與液體密度相近，因此分子間距離縮短，分子間相互作用大大增強，溶解作用近似于液體；粘度低于液體而與氣體的粘度相近，擴散系數(shù)卻比液體大10100倍，有利于成分的擴散溶解；超臨界流體的密度、粘度和擴散系數(shù)等，都與溫度、壓力和流體組成有關(guān)。 可用作超臨界流體的物質(zhì)很多，如二氧化碳、一氧化氮、甲烷、乙烷、六氟化硫、氨等。目前使用最為廣泛的是二氧化碳，其臨界溫度31.3）低，可在常溫下操作，并對大部分物質(zhì)呈化學(xué)惰性。這樣，使中藥中的化學(xué)成分能在低溫條件下安全地被萃取出來

6、，有效地防止了“熱敏性或化學(xué)不穩(wěn)定性成分的氧化和逸散，使萃取物保持中藥的全部成分。 2基本原理 超臨界流體萃取的原理主要是根據(jù)超臨界流體對物質(zhì)有很強的溶解能力，且改變溫度或壓力即可改變流體的密度、粘度和擴散系數(shù)，流體對物質(zhì)的溶解特性也隨之改變，因此，可將不同性質(zhì)的成分分段萃取或分步析出，達到萃取分離的目的。 實際應(yīng)用中，一般采用程序升壓法分步萃取不同極性的成分。超臨界流體萃取成分之后，可利用減壓法，使流體膨脹，密度降低，變?yōu)闅怏w，與成分成為兩相而分離。所以此法的優(yōu)點是萃取物無殘留有機溶劑，分離后的氣體可循環(huán)使用，而且避免了溶劑對環(huán)境的污染。工藝流程簡圖見圖2-8。3超臨界流體萃取法的應(yīng)用 超臨

7、界流體萃取法始于20世紀(jì)50年代，到70年代末，該法廣泛應(yīng)用于煙草和食品工業(yè)，80年代以來，超臨界流體萃取技術(shù)在醫(yī)藥、化工、食品及環(huán)保等領(lǐng)域取得了迅速發(fā)展，特別是在中藥有效成分提取分離方面日益受到重視。目前主要用于萜類、揮發(fā)油、生物堿、黃酮、苯丙素、皂苷和芳香有機酸等成分的提取分離。在青蒿素浸膏、蛇床子浸膏、胡椒精油、肉豆蔻精油等的制備分離方面已達到產(chǎn)業(yè)化規(guī)模。三、沉淀法 沉淀法是在中藥提取液中加入某些試劑，與其中一些成分生成沉淀，或加入某些試劑后可降低一些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一種方法 如果所需要分離獲得的成分生成沉淀，則沉淀反應(yīng)必須是可逆的；如果是不需要的成分，則將生成的沉淀

8、除去，可以是不可逆的沉淀反應(yīng)。 （一乙醇沉淀法 此法是在濃縮后的水提取液中，加入一定量的乙醇，使某些難溶于乙醇的成分從溶液中沉淀析出的方法 （二酸堿沉淀法 本法是利用某些成分在酸或堿中溶解，而在堿或酸中沉淀的性質(zhì)達到分離的方法。 （三鉛鹽沉淀法 是利用中性醋酸鉛或堿式醋酸鉛在水或稀醇溶液中能與許多物質(zhì)生成難溶性的鉛鹽或鉛絡(luò)合物沉淀，而使各成分得以分離的方法。 鉛鹽沉淀法既可用來除去雜質(zhì)，也可用來沉淀有效成分。 脫鉛方法 1通入硫化氫氣體法 2硫酸鹽或磷酸鹽 3陽離子交換樹脂法 （四鹽析法 此法是向混合物水溶液中加入易溶于水的無機鹽至一定濃度或成飽和狀態(tài)，使某些中藥成分在水中溶解度降低而析出，達

9、到與其他雜質(zhì)分離的目的。常用于鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。 四、結(jié)晶法 從非結(jié)晶狀物質(zhì)通過處理得到結(jié)晶狀物質(zhì)的過程稱為結(jié)晶。用反復(fù)結(jié)晶的方法，從不純的結(jié)晶制得較純結(jié)晶的過程稱為重結(jié)晶。結(jié)晶法往往用于固體物質(zhì)的精制純化，是利用混合物中各成分對某種溶劑溶解度的差別，使單一成分以結(jié)晶狀態(tài)析出，從而達到分離目的。 （一結(jié)晶的具體操作 選用合適的溶劑，將已初步提純的混合物加熱溶解，形成有效成分的飽和溶液如需要脫色時，可加適量活性炭），趁熱濾去不溶雜質(zhì)，濾液低溫放置或蒸去部分溶劑后再低溫放置，使有效成分大部分析出結(jié)晶，濾過，與溶液中的雜質(zhì)相分離。 （二結(jié)晶溶劑的選擇 結(jié)晶法的關(guān)鍵是選擇

10、適宜的溶劑。恰當(dāng)?shù)娜軇┮话銘?yīng)符合下列條件： 1溶解度 對欲結(jié)晶成分熱時溶解度大，冷時溶解度小；而對雜質(zhì)則冷、熱均溶或均不溶。 2與被結(jié)晶的成分不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 3沸點 溶劑的沸點適中，若沸點過高，則附著于晶體表面不易除去，過低又不利于晶體析出。 常用于結(jié)晶的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、醋酸、吡啶等。當(dāng)用單一溶劑不能達到結(jié)晶時， 可用兩種或兩種以上溶劑組成的混合溶劑進行結(jié)晶操作。常用的混合溶劑有：水-乙醇、水-丙酮、乙醇-乙醚、乙醇-氯仿、乙醇-醋酸乙酯-乙醚等。（三結(jié)晶純度的判斷 1晶形和色澤 結(jié)晶性純凈物質(zhì)，一般具有一定的晶形和均勻的色澤?；衔锝Y(jié)晶的形狀往往因所用溶劑不同而有差異。

11、2熔點和熔距 單體化合物還應(yīng)有一定的熔點和較小的熔距。如為純凈的化合物，重結(jié)晶前后的熔點應(yīng)該一致。 3色譜分析法 晶體純度的進一步確認(rèn)，須采用色譜法，常用的有薄層色譜和紙色譜等。 若某成分經(jīng)同一溶劑數(shù)次結(jié)晶，其晶形一致，色澤均勻，熔點一定且熔距較小，同時在薄層色譜或紙色譜上，經(jīng)數(shù)種不同展開劑系統(tǒng)鑒定，均得到一個斑點，一般可認(rèn)為是一個單體化合物。 五、透析法 透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析膜，而大分子物質(zhì)不能通過透析膜的性質(zhì)達到分離的方法圖2-9）。 透析法分離效果的關(guān)鍵是根據(jù)欲分離成分的具體情況選用規(guī)格適宜的透析膜。透析膜有動物性膜、火棉膠膜、羊皮紙膜硫酸紙膜）、蛋白膠膜、玻璃紙膜等

12、。 透析法分離量較小，時間長，一般在實驗室中應(yīng)用較多。六、分餾法 此法是利用混合物中各成分沸點的不同進行分離的方法。適用于能夠完全互溶的液體混合物的分離。在中藥化學(xué)成分的研究工作中，常用分餾法分離揮發(fā)油及一些液體生物堿。 一般液體混合物沸點相差在100以上，可將溶液重復(fù)蒸餾多次，即可達到分離的目的，如沸點相差在25以下，則需采用分餾法圖2-10）。沸點相差越小，需要的分餾裝置越精細。七、色譜法 色譜法chromatography又稱層析法，是一種分離和鑒定化合物的有效方法，其最大的優(yōu)點在于分離效能高、快速簡便。對一些結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似化合物的分離，用經(jīng)典的萃取法、沉淀法和結(jié)晶法等難以達到分離目的時，

13、用色譜法往往可以收到很好的分離效果。 色譜法根據(jù)分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜與離子交換色譜等； 根據(jù)分離方法又可分為： 薄層色譜法thin layer chromatography，TLC） 柱色譜法column chromatography） 紙色譜法paper chromatography，PC） 高效液相色譜法和氣相色譜法等 色 譜 法 分 類GC填 充 柱 色 譜 法毛 細 管 柱 色 譜 法GSC ,GLCLC柱 色 譜 法經(jīng) 典 液 相 色 譜 法 ?高 效 液 相色 譜 法（ HPLC）平 面 色 譜 法薄 層 色 譜 法紙 色 譜 法（ TLC）LSC(PC)L

14、LCIECMEC毛 細 管 電 泳 色 譜 法(CE)（一吸附色譜法 1基本原理 2常用吸附劑 （1硅膠 （2氧化鋁 硅膠和氧化鋁含水量越高、活性級別越大，吸附活性越弱。 只要在110左右加熱，這些“自由水” 就能被可逆性地除去。利用這一原理可以對吸附劑進行活化去水和脫活化加水處置，以控制吸附劑的活性。 硅膠、氧化鋁的含水量與活性級別活性級別 硅膠含水量% 氧化鋁含水量% 0 0 5 3 15 6 25 10 38 15 （3聚酰胺 （4活性炭 1粉末狀活性炭 2顆粒狀活性炭 3錦綸活性炭 3展開劑 化合物被吸附劑吸附后，需用合適的溶劑進行展開，這種溶劑稱為展開劑，在柱色譜中習(xí)慣稱為洗脫劑。展

15、開劑在吸附色譜中主要作用是解吸附。 在吸附色譜中，展開劑的展開能力與其極性有關(guān)。對于極性吸附劑，展開劑的極性越大，其展開能力越強，化合物在色譜中移動的速度就越快，而對非極性吸附劑則相反，展開劑的極性越小，其展開能力越強。 4被分離成分 被分離成分與吸附劑、展開劑共同構(gòu)成了吸附色譜中的三要素。 對硅膠、氧化鋁等極性吸附劑來說，對極性大的化合物吸附強，移動慢，Rf值??；而對極性小的化合物吸附弱，Rf值大，從而將各成分分離開。全面考慮吸附劑、展開劑和被分離成分三者的相互關(guān)系，是分離成敗的關(guān)鍵。 5操作方式 吸附色譜常見的操作方式是薄層色譜和柱色譜。薄層色譜主要用于化學(xué)成分的預(yù)試、鑒定及探索柱色譜分離

16、的條件，柱色譜主要用于化學(xué)成分的分離制備及含量測定。 （1吸附薄層色譜法 此法是將吸附劑均勻地鋪在玻璃板上形成薄層，把欲分離的試樣溶液點加到薄層板的一端，然后用合適的展開劑展開，使混合物中各成分得以分離的方法。 吸附薄層色譜的操作主要包括鋪板制板）、點樣、展開和顯色四個方面。實際工作中常用硅膠-羧甲基纖維素鈉硅膠CMC-Na薄層板，展開方式有上行法、下行法、單向展開、雙向展開等多種。 將計算出的Rf值與已知化合物的Rf值對照，也可與文獻上記載的Rf值比較，進行定性鑒別。 原 點 中 心 至 斑 點 中 心 的 距 離原 點 中 心 至 展 開 劑 前 沿 的 距 離 Rf= 薄層色譜廣泛應(yīng)用于

17、植物各類化學(xué)成分的分離鑒定，也可應(yīng)用于中草藥品種、藥材及其制劑真?zhèn)蔚臋z查、質(zhì)量控制和資源調(diào)查。藥典一部采用薄層色譜法作鑒別的中藥材和中藥成方制劑品種已達1523種（2吸附柱色譜法 吸附柱色譜法是將試樣加入到一定規(guī)格裝有吸附劑的玻璃柱里，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?，使結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同的成分達到分離的方法。其分離原理、吸附劑和洗脫劑的選擇均與吸附薄層色譜法基本相同。柱色譜的具體操作可分為裝柱、加樣和洗脫三步。（二分配色譜法 分配色譜法是一種利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)的不同，進行分離的色譜方法。 1基本原理 1基本原理 分配色譜的原理來自于兩相溶劑萃取法。 2載體 載體又稱支持劑、擔(dān)體，在

18、分配色譜中只起支持固定相的作用，對被分離成分無吸附作用，而且作為分配色譜的載體均為中性多孔粉末，不溶于兩相溶劑中，也不與被分離成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 3固定相、流動相與被分離成分 據(jù)固定相與流動相的極性差別，分配色譜有正相與反相色譜法之分。在正相分配色譜法中，流動相的極性小于固定相極性，而在反相分配色譜法中，流動相的極性則大于固定相的極性。 反相分配色譜法應(yīng)用廣泛，其常用的固定相是在普通硅膠表面進行化學(xué)修飾，鍵合上長度不同的烴基R形成親脂性表面，習(xí)稱鍵合相，如十八烷基或辛基硅烷鍵合相。 4操作方式 （1紙色譜法 （2分配薄層色譜法 （3分配柱色譜法 （三高效液相色譜法high performanc

19、e liquid chromatography，HPLC） 此法是在經(jīng)典的液相色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種快速分離分析新技術(shù)。是采用了高效填充劑，利用加壓手段加快流動相流速的一種高效能液相色譜法。按分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜及凝膠色譜等，其中液液分配色譜應(yīng)用最廣泛，根據(jù)其固定相與流動相極性的差別，亦分為正相分配色譜和反相分配色譜兩類。正相色譜主要用于極性物質(zhì)的分離測定；反相色譜主要用于非極性、中等極性物質(zhì)的分離測定。 高效液相色譜儀由輸液泵、進樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理器等組成圖2-11）。 羥基喜樹堿（）R1=R2=OH喜樹堿（）R1=OH，R2=H10-甲氧基喜樹堿

20、（）R1=OH，R2=OCH3 脫氧喜樹堿（）R1=R2=HNR2NOOOR1 高效液相色譜法分離速度快、效率高、試樣分析重現(xiàn)性好，而且試樣不需氣化，只需制成溶液，即可在室溫下進樣分析，所以此法應(yīng)用范圍極廣，對揮發(fā)性差或遇熱不穩(wěn)定的成分及某些高分子化合物的分離極為有利。近年來，高效液相色譜除了在中藥化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用外，在有機化工、環(huán)境化學(xué)及高分子工業(yè)等方面也得到了廣泛應(yīng)用。 （四氣相色譜法gas chromatography，GC） 此法是以氣體作為流動相的一種色譜方法。流動相的氣體又叫載氣，常用的是氮氣。氣相色譜法就其操作形式而言屬于柱色譜法。根據(jù)流動相和固定相的狀態(tài)及分離原理的不同又可分為氣-

21、固吸附色譜和氣-液分配色譜兩種，氣-液分配色譜應(yīng)用最廣。本法所用的儀器是氣相色譜儀。 氣相色譜法是現(xiàn)代應(yīng)用較廣泛的一種分離分析技術(shù)，具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高、試樣用量少，還可制備高純度物質(zhì)等優(yōu)點。不足之處是試樣需加熱氣化，不適宜分離高沸點、熱穩(wěn)定性差、極性大的化合物。中藥中揮發(fā)油類成分因其沸點低、易揮發(fā)，故氣相色譜法特別適宜對其進行分離鑒定和含量測定。 （五凝膠色譜法(gel filtration chromatography，GFC) 凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法、凝膠濾過色譜法、分子篩色譜法等。是一種以凝膠為固定相分離分子大小不同成分的液相色譜法。具有設(shè)備簡單，操作方便，結(jié)果準(zhǔn)

22、確，凝膠可反復(fù)使用等優(yōu)點，成為天然藥物化學(xué)和生物化學(xué)研究中的常規(guī)分離分析方法。1分離原理 凝膠色譜法的原理主要是分子篩作用，根據(jù)凝膠的孔徑和被分離物質(zhì)分子的大小而達到分離目的。 凝膠顆粒用適宜的溶劑浸泡溶脹后，裝入色譜柱中，加樣后用同一溶劑洗脫。由于凝膠顆粒上有許多一定大小的網(wǎng)孔，被分離物質(zhì)的分子大小不同，進入到凝膠顆粒內(nèi)部的能力也不同。當(dāng)混合物溶液通過凝膠柱時，比凝膠孔隙大的分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能隨洗脫劑在顆粒間隙移動；比凝膠孔隙小的分子則可自由滲入并擴散到凝膠顆粒內(nèi)部，通過色譜柱時阻力增大，流速變緩。這樣不同大小分子的移動速率有差異，在經(jīng)歷一段時間流動并達到動態(tài)平衡后，化合物即按分

23、子由大到小的順序先后流出而得到分離圖2-13）。 2凝膠的種類與性質(zhì) 商品凝膠的種類很多，常用的有葡聚糖凝膠和羥丙基葡聚糖凝膠。OCH2OHOHOHOOCH2OHOOHOOCH2OHOHOHOOOCH2OHOHOCH2CHOHCH2OOOHOHCH2OOCH2OHOHOHOOO CH2CHOHCH2O交聯(lián)葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu) 羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20是葡聚糖凝膠G-25經(jīng)羥丙基化處理得到的產(chǎn)物。此時，羥丙基代替了葡聚糖分子中羥基上的氫，成醚鍵結(jié)合狀態(tài)： ROHROCH2CH2CH2 OH羥丙基化3凝膠色譜的應(yīng)用 凝膠色譜法在中藥化學(xué)成分的分離純化工作中被廣泛應(yīng)用，尤其是一些大分

24、子化合物如蛋白質(zhì)、酶、多肽、甾體、多糖、苷類等的分離，效果較好。另外還可用于脫鹽、吸水濃縮、除熱源及粗略測定高分子物質(zhì)的分子量等方面。（六離子交換色譜法ion exchange chromatography，IEC） 1離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)及性能 CHCH2CHCH2CHCH2SO3HSO3HSO3HCHCH2CHCH2CHSO3HSO3H （1樹脂母核 （2離子交換基團 根據(jù)交換基團性質(zhì)的不同，樹脂分為兩大類，含有陽離子交換基團的樹脂稱陽離子交換樹脂，能電離出氫離子與溶液中的同電荷離子進行可逆交換；含有陰離子交換基團的樹脂稱陰離子交換樹脂，能電離出氫氧根離子，與溶液中的同電荷離子進行可逆交換。

25、每類樹脂又根據(jù)其交換基團的酸性或堿性強弱進行分類 陽離子交換樹脂有強酸型 -SO3H和弱酸型 -COOH 。 陰離子交換樹脂有強堿型 -N+(CH3)3OH 和弱堿型 -NR2、-NHR、-NH2等。 離子交換樹脂的交換能力即交換容量，取決于樹脂所含離子交換基團的數(shù)量，其單位是mmol/g。 2離子交換原理 離子交換色譜是以離子交換樹脂為固定相，以水或含有機溶劑的緩沖液為流動相。離子交換色譜的原理可用下列平衡式表示： 式中RSO3 H +、RN+(CH3)3OH 分別代表陽離子和陰離子交換樹脂，在水中可分別電離出H +和OH ，其中H +與Na+ 交換，OH 與Cl交換，使反應(yīng)不斷地向右方向進行，直至交換完全