蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用及研究方法

1、蛋白質(zhì)相互作用及蛋白質(zhì)相互作用及研究方法研究方法沈沈 波波基基 礎礎 醫(yī)醫(yī) 學學 院院病原生物學系病原生物學系025-86862793025-86862793 * DNA * RNA * ProteinCell assembly and function/Cell assembly and function/細胞組裝與功能細胞組裝與功能MessengerHeadquarterExecutor Stable, DNA mutationStable/Versatile, rRNA, tRNA, mRNAVersatile, Protein modificationProtein-Protein i

2、nteractionProtein-Other component interaction 已有超過已有超過10001000個物種的基因組完成測序，大個物種的基因組完成測序，大量的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，然而單純的基因組量的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)，然而單純的基因組DNADNA序序列尚不能解答許多生命問題。列尚不能解答許多生命問題?；蚧蚴鞘窍鄬o態(tài)相對靜態(tài)的的，而基因編碼的產(chǎn)物，而基因編碼的產(chǎn)物蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)則是動態(tài)的，具有則是動態(tài)的，具有時空性和調(diào)節(jié)性時空性和調(diào)節(jié)性，是生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)，是生物功能的主要體現(xiàn)者和執(zhí)行者。蛋白質(zhì)的表達水平、存在方式以及相互作行者。蛋白質(zhì)的表達水平、存在方式以及相互作

3、用等直接與生物功能相關。用等直接與生物功能相關。 蛋白質(zhì)序列特點和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)序列特點和結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)進化過程和保守序列蛋白質(zhì)進化過程和保守序列 蛋白在細胞內(nèi)的定位及其相關聯(lián)的細胞器蛋白在細胞內(nèi)的定位及其相關聯(lián)的細胞器 蛋白質(zhì)表達譜蛋白質(zhì)表達譜 蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況蛋白質(zhì)翻譯后修飾情況 了解與其相關聯(lián)的其他細胞蛋白質(zhì)了解與其相關聯(lián)的其他細胞蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)信息的不同層次蛋白質(zhì)信息的不同層次蛋白質(zhì)之間的相互作用蛋白質(zhì)之間的相互作用是細胞進行一切活動的是細胞進行一切活動的基礎基礎。蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復合物是細胞各種基本功能的主要完成成的蛋白

4、復合物是細胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNADNA的復制的復制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導和代謝與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。 蛋白質(zhì)間相互作用研究的重要性蛋白質(zhì)間相互作用研究的重要性Human protein-protein interaction (PPI) networkHuman protein-protein interaction (PPI) networkTowards a proteome-scale map of the hu

5、man proteinprotein interaction networkRual, Vidal et al. Nature 437, 1173-1178 (2005) 錯誤的蛋白質(zhì)相互作用可能導致疾病錯誤的蛋白質(zhì)相互作用可能導致疾病 如如 Alzheimers disease, beta- Alzheimers disease, beta-淀粉樣結(jié)構(gòu)的堆積淀粉樣結(jié)構(gòu)的堆積（alpha-synucleinalpha-synuclein與與synphilin-1synphilin-1結(jié)合）；結(jié)合）； Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and

6、 promotes the Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions. formation of cytosolic inclusions. Nat Genet. 1999;22(1):110-4Nat Genet. 1999;22(1):110-4 如尤文氏肉瘤融合蛋白（如尤文氏肉瘤融合蛋白（EWS-FLI1EWS-FLI1）可黏附于另一個）可黏附于另一個RNARNA解旋解旋A A蛋白（蛋白（RHARHA）控制基因轉(zhuǎn)錄。）控制基因轉(zhuǎn)錄。 A sm

7、all molecule blocking oncogenic protein EWS-FLI1 A small molecule blocking oncogenic protein EWS-FLI1 interaction with RNA helicase A inhibits growth of Ewings interaction with RNA helicase A inhibits growth of Ewings sarcoma. sarcoma. Nat Med. 2009;15(7):750-6.Nat Med. 2009;15(7):750-6.蛋白質(zhì)相互作用分析研究思

8、路蛋白質(zhì)相互作用分析研究思路一、鑒定與某個感興趣的蛋白質(zhì)相互作用的所有可一、鑒定與某個感興趣的蛋白質(zhì)相互作用的所有可能的蛋白質(zhì)。（能的蛋白質(zhì)。（暫不考慮生理功能暫不考慮生理功能）二、詳細描述鑒定出蛋白的生物功能及相互作用對二、詳細描述鑒定出蛋白的生物功能及相互作用對其功能的影響。（其功能的影響。（研究盡可能接近胞內(nèi)條件研究盡可能接近胞內(nèi)條件）三、運用高通量方法鑒定調(diào)節(jié)這種作用的關鍵因子。三、運用高通量方法鑒定調(diào)節(jié)這種作用的關鍵因子。等離子表面共振技術(shù)等離子表面共振技術(shù)SPRSPR免疫共沉淀免疫共沉淀Co-PICo-PIFar Western blot Far Western blot 串聯(lián)親和

9、層析串聯(lián)親和層析TAPTAP融合蛋白沉降技術(shù)融合蛋白沉降技術(shù)GST-Pull downGST-Pull downIn vitro酵母雙雜交酵母雙雜交Yeast Two-hybridYeast Two-hybrid噬菌體展示噬菌體展示Phage displayPhage displayIn vivo熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRETFRET蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究方法蛋白質(zhì)相互作用研究方法蛋白芯片蛋白芯片Protein Chip Protein Chip 細胞內(nèi)共定位細胞內(nèi)共定位Cellular colocalizationCellular colocalizationTwo-hy

10、brid system Two-hybrid system 是是9090年代初發(fā)展起來的新方法。在年代初發(fā)展起來的新方法。在真核模式真核模式生物酵母生物酵母中進行的，研究中進行的，研究活細胞內(nèi)活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關系的技術(shù)。到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關系的技術(shù)。Saccharomyces cerevisiae一、酵母雙雜交系統(tǒng)一、酵母雙雜交系統(tǒng) 1989 Stanley Fiel

11、ds lab published 1989 Stanley Fields lab published the first report on Yeast Two-Hybrid the first report on Yeast Two-Hybrid assay. assay. Fields S, Song O. A novel genetic system to detect Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 1989, protein-protein

12、 interactions. Nature, 1989, 340(6230):245-246 340(6230):245-246 /sfields/yp_interactions/index.html 酵母激活因子酵母激活因子GAL4GAL4：N N端：端：147147個氨基酸組成的個氨基酸組成的DNADNA結(jié)合域結(jié)合域(DNA binding domain, BD)(DNA binding domain, BD)C C端：端：113113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activation (t

13、ranscription activation domain, AD)domain, AD) DNADNA結(jié)合域可以和上游激活序列結(jié)合域可以和上游激活序列(upstream activating (upstream activating sequencesequence，UAS)UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UASUAS下游的基因進行轉(zhuǎn)下游的基因進行轉(zhuǎn)錄錄 。當兩者單獨存在時，不能激活轉(zhuǎn)錄；當兩者在空間上充分接近。當兩者單獨存在時，不能激活轉(zhuǎn)錄；當兩者在空間上充分接近時，可以啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。時，可以啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。1985 MarK Patshnes la

14、b demonstrated modularity of DNA binding 1985 MarK Patshnes lab demonstrated modularity of DNA binding transcription activators.transcription activators.酵母雙雜交系統(tǒng)的原理酵母雙雜交系統(tǒng)的原理ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneGAL4 UASPromoterl

15、acZ(or HIS) reporter geneXDNA-BD誘餌蛋白（誘餌蛋白（baitbait）BD-XBD-X與BD融合的蛋白表達載體，其表達的蛋白 靶蛋白（靶蛋白（preyprey）AD-YAD-Y與AD融合的蛋白表達載體，其表達的蛋白 宿主菌株宿主菌株經(jīng)改造的、含一個或多個報告基因的重組質(zhì)粒的宿主細胞。Components of the system載體中加入進行營養(yǎng)型篩選的基因載體中加入進行營養(yǎng)型篩選的基因v 基因組中基因組中是缺失型的是缺失型的v 基因組也不能合成基因組也不能合成ADEADE、 HIS HIS 、LEULEU、TRP TRP （因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上

16、無法正常生長）改造后的酵母細胞的特點：改造后的酵母細胞的特點：常見報告基因常見報告基因通過通過功能互補和顯色反應功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落篩選到陽性菌落培養(yǎng)基類型培養(yǎng)基類型pGADT7 Amp+ -LeupGBKT7 Kan+ -Trp單缺單缺雙缺雙缺四缺四缺酵母雙雜交實驗過程酵母雙雜交實驗過程Fishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-bindingdoma

17、intransfectiontransformedyeastXWell start by making transformed yeast expressing XFishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-bindingdomaintransfectiontransformedyeastXunknowpredatortissuetotal mRNAreverse

18、transcriptasecDNAyeast plasmid expression vectortransfectionY?activationdomaintransformedyeastNow well make transformed yeast expressing Y, if Ydoes indeed exist.Fishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-

19、bindingdomaintransfectiontransformedyeastXunknowpredatortissuetotal mRNAreverse transcriptasecDNAyeast plasmid expression vectortransfectionextract plasmidstransfectionre-transformedyeastXY?activationdomainNow we make re-transformed yeast.We have a Y if we have expression of the (lac) reporter gene.

20、Fishing with the yeast two-hybrid systemXYdoes X bindwith a protein?baitpredatortranscription machineryXYbaitpreylac 2-galactosidaseX-galblue colorprotein XbaitcDNA for Xyeast plasmidexpression vector DNA-bindingdomaintransfectiontransformedyeastXunknowpredatortissuetotal mRNAreverse transcriptasecD

21、NAyeast plasmid expression vectortransfectionextract plasmidstransfectionre-transformedyeastXY?agar plateactivationdomainpositive yeastcontaining bait plus predator!the fishingwas good! 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNAcDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜

22、(PPI)(PPI) 在藥物設計中的應用在藥物設計中的應用酵母雙雜交系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀酵母雙雜交系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀1 1）發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能）發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的新功能 將已知基因作為將已知基因作為誘餌誘餌，在選定的，在選定的cDNAcDNA文庫中篩選與文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到可以分離得到AD-AD-文庫載體，并從載體中進一步克隆得文庫載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的到隨機插入的cDNAcDNA片段，并對該片段的編碼序列在片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANKGENEBANK中

23、進行比較，研究與已知基因在生物學功能上中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。的聯(lián)系。 2 2）構(gòu)建基因組蛋白連鎖圖）構(gòu)建基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein-protein Interaction MapGenome Protein-protein Interaction Map，PPIPPI） 基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上基因組中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著功能上的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的聯(lián)系。通過基因組的測序和序列分析發(fā)現(xiàn)了很多新的基因和的基因和ESTEST序列。序列。 利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已知基因和利用酵母雙雜交技術(shù)，將所有已

24、知基因和ESTEST序序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。從而找到基因之間的聯(lián)系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途對于認識一些重要的生命活動：如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。徑等有重要意義。Genome protein-protein Interaction map3 3）篩選藥物的作用位點以及藥）篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響 對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白相互作用可采取對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白相互作

25、用可采取藥藥物干擾物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。目的。酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點1.1. 高敏感性高敏感性 采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達；白過量表達； 激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復合體使融合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定； 檢測的結(jié)果是基因表達產(chǎn)物的累積效應，可檢檢測的結(jié)果是基因表達產(chǎn)物的累積效應，可檢

26、測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點1.1. 高敏感性。高敏感性。2.2. 真實性真實性-檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。3.3. 簡潔性簡潔性-融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。4.4. 廣泛性廣泛性-采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDN

27、A文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質(zhì)。文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題酵母雙雜交系統(tǒng)中常見問題（一）（一） 假陽性較多假陽性較多（二）（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低轉(zhuǎn)化效率偏低（三）（三） 陰性干擾陰性干擾v假陽性定義假陽性定義 在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活互作用的情況下，報告基因仍被激活。（一）（一） 假陽性較多假陽性較多 BDBD融合誘餌蛋白的單獨激活作用融合誘餌蛋白的單獨激活作用( (自激活現(xiàn)象自激活現(xiàn)象） ADAD融合靶蛋白有融合靶蛋白有DNADNA的特異性結(jié)合，則可單獨激活報告的特異性結(jié)合，

28、則可單獨激活報告基因的表達?；虻谋磉_。 ADAD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報告基因；融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報告基因； 蛋白過表達導致非生理情況下的結(jié)合蛋白過表達導致非生理情況下的結(jié)合原因：原因：排除假陽性的措施排除假陽性的措施 作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定?；顖蟾婊虻蔫b定。-如存在自激活，雙雜交前刪除該片段，如存在自激活，雙雜交前刪除該片段，但應保留相互作用的結(jié)構(gòu)域但應保留相互作用的結(jié)構(gòu)域 采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同。不

29、相同。-目前多數(shù)載體已采用。目前多數(shù)載體已采用。進一步分析：進一步分析： 這種相互作用是否會在細胞內(nèi)自然發(fā)生。這種相互作用是否會在細胞內(nèi)自然發(fā)生。 有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有些蛋白依賴于泛素的蛋白酶降解途徑成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用。有普遍的蛋白間的相互作用。 一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也一些實際沒有相互作用的蛋白但有相同的模體蛋白也可發(fā)生相互作用?？砂l(fā)生相互作用。酵母轉(zhuǎn)化效率較細菌酵母轉(zhuǎn)化效率較細菌低低4 4個數(shù)量級個數(shù)量級，轉(zhuǎn)化成為雙雜交，轉(zhuǎn)化成為雙雜交技術(shù)的技術(shù)的瓶頸瓶頸。辦法辦法：引進酵母接合型引進酵母接合型 a a接合型和接合型和 接

30、合型（兩者之間可，但自身不能接合型（兩者之間可，但自身不能形成二倍體）形成二倍體）（二）（二） 轉(zhuǎn)化效率偏低轉(zhuǎn)化效率偏低菌落篩選菌落篩選藍白斑藍白斑篩選篩選（三）陰性干擾（三）陰性干擾融合蛋白的表達融合蛋白的表達對細胞有毒性對細胞有毒性，該怎么辦？該怎么辦？ 應選擇應選擇敏感性較低敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體的菌株或拷貝數(shù)低的載體蛋白間的蛋白間的相互作用較弱相互作用較弱， 應選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。應選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。蛋白在酵母中蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達不能穩(wěn)定地表達，或者，或者不能正確地折疊不能正確地折疊，或雜，或雜交蛋白交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核不能轉(zhuǎn)入胞核。 在細胞表面發(fā)

31、生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。兩個蛋白本應發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表兩個蛋白本應發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。達程度甚低以至于檢測不出來。原因：原因： 酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白- -蛋白間相互蛋白間相互作用的有效和快速的方法，作用的有效和快速的方法， 有多方面的應用，有多方面的應用， 但仍存在一些但仍存在一些局限性局限性。 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結(jié)果一定要通過其它的實驗手段來驗證。其它的實驗手段來驗證。酵母雙雜交系統(tǒng)使用注意事項酵母雙雜交系統(tǒng)使用

32、注意事項 在酵母雙雜交的基礎上，又發(fā)展：在酵母雙雜交的基礎上，又發(fā)展：酵母單雜交酵母單雜交分析分析DNADNA和文庫蛋白之間的作用和文庫蛋白之間的作用酵母三雜交酵母三雜交-分析蛋白和分析蛋白和RNARNA間的相互作用間的相互作用酵母的反向雜交酵母的反向雜交-兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點。兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點。酵母雙雜交相關技術(shù)酵母雙雜交相關技術(shù)酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng) 在酵母單雜交系統(tǒng)中，用特異的在酵母單雜交系統(tǒng)中，用特異的DNADNA序列取代序列取代DNA Gal4DNA Gal4結(jié)合位點。結(jié)合位點。 該該DNADNA序列在相關生物系統(tǒng)中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。序列在相關生物系統(tǒng)

33、中是重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。 靶靶DNADNA序列特異的結(jié)合蛋白序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)(BDPX)與與Gal4 PGal4 P的激活結(jié)構(gòu)的激活結(jié)構(gòu)域作用可激活作為表型選擇性報告基因的表達。域作用可激活作為表型選擇性報告基因的表達。酵母單雜交系統(tǒng)應用酵母單雜交系統(tǒng)應用 確定已知確定已知DNA-DNA-蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNADNA結(jié)合位點蛋白的新基因。結(jié)合位點蛋白的新基因。定位已經(jīng)證實的具有相互作用的定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白的的DNADNA結(jié)合結(jié)

34、構(gòu)域。結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 -研究研究DNA-DNA-蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用酵母三雜交系統(tǒng)酵母三雜交系統(tǒng) 在酵母三雜交系統(tǒng)中，除在酵母三雜交系統(tǒng)中，除RNARNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白-BD-BD和待選的和待選的RNARNA結(jié)結(jié)合蛋白合蛋白-AD-AD，還需構(gòu)建一雜合，還需構(gòu)建一雜合RNARNA，含有二個不同的蛋白結(jié)合，含有二個不同的蛋白結(jié)合位點。當位點。當RNARNA與二個與二個RNARNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點相互作用時可激結(jié)合蛋白的結(jié)合位點相互作用時可激活報道基因的轉(zhuǎn)錄和表達。活報道基因的轉(zhuǎn)錄和表達。 三雜交系統(tǒng)提供了快速、多用的體內(nèi)檢測三雜交系統(tǒng)提供了快速、多用的體內(nèi)檢測RNA-RNA-蛋白間相互

35、蛋白間相互作用的新方法。作用的新方法。RNA 反向酵母雙雜交系統(tǒng)反向酵母雙雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system reverse yeast two-hybrid system ）該系統(tǒng)是一項鑒定該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報告基因。構(gòu)建一種反向篩選的報告基因。在這系統(tǒng)中，野生型在這系統(tǒng)中，野生型BD-X/AD-YBD-X/AD-Y間的相互作用激活一種間的相互作用激活一種URA3URA3報告基因，使酵母宿主報告基因，使酵母宿主-URA-URA（uraura缺失）培養(yǎng)基上生長；但缺失）培

36、養(yǎng)基上生長；但URA3URA3編碼的酶類可以使編碼的酶類可以使5-FOA5-FOA變成對細胞有毒性的物質(zhì)，使酵變成對細胞有毒性的物質(zhì)，使酵母細胞在含母細胞在含5-FOA5-FOA的培養(yǎng)基上不能生長。在此情況下的培養(yǎng)基上不能生長。在此情況下BD-X/AD-BD-X/AD-Y Y作用的解離作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。利用這種方法能方便地鑒定利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因作用缺陷等位基因、解離肽或解離肽或相關的小分子物質(zhì)相關的小分子物質(zhì)。-Ura5-FOA這個改造的酵母菌株在缺這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當上只有

37、當“誘餌誘餌”和和“獵獵物物”相互作用激活相互作用激活URA3URA3基基因的表達才能生長。因的表達才能生長。在含有在含有5-FOA5-FOA的完全培的完全培養(yǎng)基上養(yǎng)基上“餌餌”和和“獵物獵物”的相互作用則抑制細的相互作用則抑制細胞的生長。胞的生長。有相互作用有相互作用無相互作用無相互作用+- 反向酵母雙雜交系統(tǒng)反向酵母雙雜交系統(tǒng)（ reverse yeast two-hybrid system ）Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to

38、detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(19):10315-10320.反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應用反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應用 研究蛋白間作用的研究蛋白間作用的關鍵位點關鍵位點或起決定作用的個別氨基或起決定作用的個別氨基酸，酸， 進而分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關系。進而分析蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關系。 篩選能篩選能阻止某些蛋白間相互作用的肽阻止某些蛋白間相互作用的肽或小分子物質(zhì)用或小分子物質(zhì)用作臨床治療制劑。作臨床治療制劑。 利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進行

39、預清除，則可能大大利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進行預清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質(zhì)連鎖雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設想。圖譜的設想。 細菌雙雜交：細菌雙雜交：操作簡單，周期短操作簡單，周期短2-32-3天天可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用可研究膜蛋白或跨膜蛋白相互作用哺乳細胞雙雜交：哺乳細胞雙雜交：蛋白有翻譯后修飾，可正確地折疊蛋白有翻譯后修飾，可正確地折疊報告基因：熒光素酶，堿性磷酸酶和報告基因：熒光素酶，堿性磷酸酶和 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶酵

40、母雙雜交相關技術(shù)酵母雙雜交相關技術(shù)Figure. Schema of the high-throughput yeast two-hybrid pipeline. Nature. 2005 Oct 20;437(7062):1173-8. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.Examplethe leader in enzyme technology二、噬菌體展示技術(shù)是一項篩選技術(shù)，將目標蛋白的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當位置，使外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋

41、白融合表達，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面。被展示的多肽或蛋白質(zhì)可保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物學活性。Smith在1985年首次證實外源DNA可以插入絲狀噬菌體基因III中，并與pIII蛋白融合展示。Smith GP. Science 1985; 228:1315-7/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)不同不同分為：分為：M13M13噬菌體展示系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)、T7T7噬菌體、噬菌體、T4T4噬菌體與噬菌體與 - -噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示

42、系統(tǒng)噬菌體展示系統(tǒng)的分類：噬菌體展示系統(tǒng)的分類：絲狀噬菌體絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體蝌蚪形噬菌體噬菌體、噬菌體、T4T4噬菌體、噬菌體、T7T7噬菌體噬菌體M13M13噬菌體噬菌體展示內(nèi)容展示內(nèi)容 （文庫）不同（文庫）不同包括：包括：隨機肽段隨機肽段文庫文庫、天然肽段天然肽段文庫文庫、cDNAcDNA文庫文庫、抗體抗體文庫文庫（抗體片段）（抗體片段）、蛋白質(zhì)文庫蛋白質(zhì)文庫等等噬菌體展示系統(tǒng)的分類：噬菌體展示系統(tǒng)的分類：the leader in enzyme technologyLife Cycle of M13以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復制合成組裝病毒所需的ssDNA。 基

43、因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（主要衣殼蛋白 pVIII和次要衣殼蛋白 pIII）。 感染宿主后通常不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37oC）。 感染后1小時內(nèi)平均每個細胞分泌1000個噬菌體。the leader in enzyme technology主要衣殼蛋白主要衣殼蛋白 pVIII pVIII和次要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白 pIII pIIIPIIIPIIIPVIIIPVIII展示多肽展示多肽300aa300aa10aa10aa展示數(shù)量展示數(shù)量低價（約低價（約5 5個拷貝個拷貝

44、）高價（高達高價（高達27002700個拷貝）個拷貝）配體結(jié)合力配體結(jié)合力親和力親和力非常低非常低高高親和力親和力插入部位插入部位N N 端、近端、近N N 端或端或N N 端與端與C C 端的柔性端的柔性連接區(qū)融合連接區(qū)融合N N 端或近端或近N N 端融端融合合衣殼蛋白衣殼蛋白General selection scheme for cDNA expression-products displayed on phagesurface. Konthur et al 2003 TARGETS Vol. 2, No.6 261-270.噬菌體展示操作流程噬菌體展示操作流程噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點噬菌

45、體展示技術(shù)的優(yōu)點 非展示系統(tǒng)非展示系統(tǒng) 展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點特定分子的基因型和其表型統(tǒng)一在同一個噬菌體顆粒內(nèi)，特定分子的基因型和其表型統(tǒng)一在同一個噬菌體顆粒內(nèi)，將將重組蛋白質(zhì)篩選與基因篩選合二為一重組蛋白質(zhì)篩選與基因篩選合二為一。被展示的多肽或蛋白可以被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。，以利于靶分子的識別和結(jié)合。淘選的高效率使陽性克隆在微量存在的情況下，通過感染淘選的高效率使陽性克隆在微量存在的情況下，通過感染得到得到擴增富集擴增富集。操作操作簡單易行簡單易行，在幾周內(nèi)即可篩選，

46、在幾周內(nèi)即可篩選10106 610108 8克隆克隆噬菌體隨機肽庫具有噬菌體隨機肽庫具有容量大、體積小、篩選簡便、制備成容量大、體積小、篩選簡便、制備成本低、可多次擴增本低、可多次擴增等突出優(yōu)點。等突出優(yōu)點。噬菌體展示技術(shù)的局限性噬菌體展示技術(shù)的局限性所建庫的容量所建庫的容量（109）和分子多樣性受到限制；和分子多樣性受到限制；噬菌體展示文庫一旦建成，很噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突難再進行有效的體外突變和重組變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內(nèi)基因的表達，所以由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內(nèi)基因的表達，所

47、以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。到有效表達和展示。 少數(shù)多肽由于疏水性，或由于影響外膜蛋白的折疊而少數(shù)多肽由于疏水性，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。不能展示在噬菌體表面。 噬菌體展示的應用噬菌體展示的應用抗原表位分析抗原表位分析蛋白質(zhì)相互作用位點的確定蛋白質(zhì)相互作用位點的確定人工抗體和疫苗的制備人工抗體和疫苗的制備酶抑制劑的研究開發(fā)酶抑制劑的研究開發(fā)多肽藥物的研制多肽藥物的研制Targeting Plasmodium ligands on mosquito salivary glands and

48、midgut with a phage display peptide libraryProc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(23): 1327813281. Figure1. Schematic illustration of the selection protocol for phages that bind either to salivary glands (a) or to the luminal side of the midgut epithelium (b).Example三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence res

49、onance energy transfer, FRET) 當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體當供體熒光分子的發(fā)射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在個分子的距離在10nm10nm范圍以內(nèi)時，范圍以內(nèi)時，就會發(fā)生一種就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)非放射性的能量轉(zhuǎn)移移，即，即FRETFRET現(xiàn)象，使得供體的熒光現(xiàn)象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。大增強（敏化熒光）。 FRET FRET技術(shù)是目前技術(shù)是目前唯一唯一能對能對固定細胞中固

50、定細胞中的蛋白質(zhì)間相互作用或存的蛋白質(zhì)間相互作用或存在于在于活細胞活細胞蛋白質(zhì)間相互作用，提供蛋白質(zhì)間相互作用，提供定位和定量定位和定量信息的技術(shù)。信息的技術(shù)。FRETFRET熒光能量轉(zhuǎn)移熒光能量轉(zhuǎn)移FRETFRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：給體與受體在合適的距離（給體與受體在合適的距離（1 110 nm10 nm）；）；給體的發(fā)射光譜與受體的給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊吸收光譜有一定的重疊（這是能（這是能量匹配的條件）；量匹配的條件）；給體與受體的偶極具有給體與受體的偶極具有一定的空間取向一定的空間取向（這是偶極（這是偶極- -偶極耦偶極耦合作用的

51、條件）。合作用的條件）。1) 1) 熒光蛋白熒光蛋白: : 一類能發(fā)射熒光的天然蛋白及其突變體。一類能發(fā)射熒光的天然蛋白及其突變體。 BFP/GFP, CFP/YFP. BFP/GFP, CFP/YFP.常用的探針常用的探針Color defining Color defining GFP GFP Blue (BFP) Blue (BFP) Green (GFP) Green (GFP) Cyan (CFP) Cyan (CFP) Yellowish Yellowish (YFP) (YFP) Red (D.s. Red (D.s. RFP) RFP) Excitation Excitatio

52、n (max)(max)382 nm382 nm434 nm434 nm488 nm488 nm514 nm514 nm558 nm558 nmEmission (max)Emission (max)446 nm446 nm476 nm476 nm509 nm509 nm527 nm527 nm583 nm583 nmSensitivity to Sensitivity to photobleachingphotobleachingHighHighLowLowLowLowModerateModerateLowLow2) 2) 傳統(tǒng)有機染料傳統(tǒng)有機染料: : 具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機化合物組

53、成具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機化合物組成的染料對。包括熒光素和青色染料的染料對。包括熒光素和青色染料Cy3/Cy5Cy3/Cy5等。（等。（優(yōu)先選擇優(yōu)先選擇）3) 3) 鑭系染料鑭系染料: : 稀土染料稀土染料, , 一般與有機染料聯(lián)用，分別作為一般與有機染料聯(lián)用，分別作為FRETFRET的供體和受體，以提高檢測的準確性和信噪比。的供體和受體，以提高檢測的準確性和信噪比。4) 4) 量子點量子點: : 量子點是一種能接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的納米顆粒。激量子點是一種能接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的納米顆粒。激發(fā)和放射光譜寬，發(fā)和放射光譜寬， 發(fā)射熒光強（發(fā)射熒光強（2020倍），穩(wěn)定（倍），穩(wěn)定（100100

54、倍）。倍）。常用的探針常用的探針FRETFRET常見的供體常見的供體- -受體熒光分子對：受體熒光分子對： 熒光蛋白類：熒光蛋白類：染料類：染料類：CFP-YFPCFP-YFPBFP-GFPBFP-GFPBFP-YFPBFP-YFPCFP-DsRFPCFP-DsRFPGFP-DsRFPGFP-DsRFPCFP-YFP-mCherryCFP-YFP-mCherry 均相檢測（無分離和洗滌步驟）均相檢測（無分離和洗滌步驟） 實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化實時連續(xù)地觀察活細胞的動態(tài)變化FRETFRET技術(shù)的優(yōu)勢和缺點技術(shù)的優(yōu)勢和缺點Fluorescence IntensityTime LigandC

55、y3Cy5熒光強度隨時間衰減，有時間限制；熒光強度隨時間衰減，有時間限制； 采集信號有噪音采集信號有噪音缺點：缺點： 假陰性問題假陰性問題 轉(zhuǎn)染效率，尤其是目標蛋白是膜蛋白時轉(zhuǎn)染效率，尤其是目標蛋白是膜蛋白時 配對的供體和受體之間距離和方向不合適，即便形成配對的供體和受體之間距離和方向不合適，即便形成復合物，復合物，F(xiàn)RETFRET也不會產(chǎn)生；也不會產(chǎn)生； 儀器的敏感度、分辨率、及影像采集和分析能力儀器的敏感度、分辨率、及影像采集和分析能力 假陽性的問題假陽性的問題 沒有相互作用的供體和受體之間相隔很近的話，也可沒有相互作用的供體和受體之間相隔很近的話，也可以發(fā)生以發(fā)生FRETFRET； 所以

56、，應結(jié)合多種蛋白相互作用的研究所以，應結(jié)合多種蛋白相互作用的研究方法（如免疫共沉淀）方法（如免疫共沉淀） FRETFRET熒光能量轉(zhuǎn)移應注意問題：熒光能量轉(zhuǎn)移應注意問題：FRETFRET應用范圍應用范圍 酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復證酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)所篩選克隆的復證 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)核酸相互作用核酸相互作用 酶活性分析酶活性分析 離子通道研究離子通道研究 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究Technique Extension- Bimolecular fluorescence complementation (BiFC, 雙分子熒光互補技術(shù)雙分子熒光互補技術(shù)) -A

57、Visual System to Investigate Protein-Protein Interactions BiFC BiFC技術(shù)是將熒光蛋白（技術(shù)是將熒光蛋白（GFPGFP、YFPYFP、CFPCFP）分割成兩個不具有熒）分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果兩個目標蛋白兩個目標蛋白因因為有相互作用而接近，就為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡熒光顯微鏡下，下，就

58、能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，對研究蛋白質(zhì)相互就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，對研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。作用有重要意義。Hu et al., Mol. Cell 9, 789798 (2002).可以在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到相互作用的蛋白發(fā)可以在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到相互作用的蛋白發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白復合物的穩(wěn)定性，以及細胞生的時間、位置、強弱、所形成蛋白復合物的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等。信號分子對其相互作用的影響等。四、細胞內(nèi)共定位實驗四、細胞內(nèi)共定位實驗(Cellular localization)(Cel

59、lular localization)直觀直觀，可以看到兩種有相互作用的蛋白，可以看到兩種有相互作用的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的質(zhì)在細胞內(nèi)的分布以及共定位的部位分布以及共定位的部位 蛋白質(zhì)細胞內(nèi)定位結(jié)果較為直觀地反應蛋白質(zhì)細胞內(nèi)定位結(jié)果較為直觀地反應蛋白在細胞內(nèi)的蛋白在細胞內(nèi)的活動狀態(tài)活動狀態(tài) 有色熒光蛋白標記技術(shù)步驟有色熒光蛋白標記技術(shù)步驟 也可稱為活細胞定位也可稱為活細胞定位分別克隆分別克隆X X，Y Y至熒光蛋白載體中至熒光蛋白載體中共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染表達表達GFP/RFPGFP/RFP融合蛋白融合蛋白confocal microscopy confocal microscopy 共聚焦顯微鏡法共聚焦顯

60、微鏡法 檢測細胞內(nèi)源性蛋白的定位及相互作用檢測細胞內(nèi)源性蛋白的定位及相互作用一抗，二抗（一抗，二抗（熒光素標記熒光素標記）“靶蛋白靶蛋白-一抗一抗-二抗二抗”免疫復合物免疫復合物對照的嚴格設置對照的嚴格設置利用雙色或多色染色的免疫熒光技術(shù)利用雙色或多色染色的免疫熒光技術(shù)進行蛋白定位步驟進行蛋白定位步驟其它研究方法的基本原理其它研究方法的基本原理五、融合蛋白沉降技術(shù)五、融合蛋白沉降技術(shù) ( (如：如：GST Pull down)GST Pull down) 利用利用GSTGST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。從混合蛋