澤瀉防治泌尿系結(jié)石有效部位工藝及藥理學(xué)研究

1、華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文澤瀉防治泌尿系結(jié)石有效部位工藝及藥理學(xué)研究姓名：劉妙娜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生藥學(xué)指導(dǎo)教師：尹春萍20080501獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，本學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果的總結(jié)。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果。對(duì)本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本人將承擔(dān)本聲明引起的一切法律后果。學(xué)位論文作者簽名：日期： 年 月 日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)

2、印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)華中科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密 ，在_年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密。（請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“” ）學(xué)位論文作者簽名： 指導(dǎo)教師簽名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文中文摘要目的：在前期國(guó)家自然科學(xué)基金（No: 39970891）研究的基礎(chǔ)上，初步確定澤瀉防治泌尿系結(jié)石有效部位為提取物中的總?cè)瞥煞?。本文?yīng)用大孔吸附樹脂分離純化澤瀉藥材中的三萜類化學(xué)成分，使其含量達(dá)到50%以上，其標(biāo)示量成分23-乙

3、酰澤瀉醇B含量達(dá)到1.29%以上，并通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證該有效部位為防治泌尿系結(jié)石的活性部位。方法與結(jié)果：1、建立了澤瀉有效部位中總?cè)频暮繙y(cè)定方法。以藥材中含量最高的三萜類23-乙酰澤瀉醇B為對(duì)照品，用5%香草醛-冰醋酸溶液，高氯酸顯色，在554nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸收度。實(shí)驗(yàn)表明23-乙酰澤瀉醇B在23.80142.8ug線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=0.0055x-0.0512，r=0.9996。該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可作為澤瀉藥材質(zhì)量監(jiān)控的有效手段。2、建立了澤瀉有效部位中23-乙酰澤瀉醇B的HPLC-ELSD含量測(cè)定方法。以23-乙酰澤瀉醇B為對(duì)照品，應(yīng)

4、用HPLC-ELSD對(duì)澤瀉有效部位中23-乙酰澤瀉醇B的含量測(cè)定進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明在23-乙酰澤瀉醇B進(jìn)樣量在0.1384ug0.6920ug之間時(shí)線性關(guān)系良好，其回歸方程為：Y=494467X-4426.9,r=0.9999。加樣回收率為99.97%,RSD為2.680%。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)也均符合要求。3、建立了澤瀉防治泌尿系結(jié)石有效部位的制備方法。首先優(yōu)化了澤瀉有效部位的提取工藝，以23-乙酰澤瀉醇B含量為指標(biāo)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)考察，確定最佳提取工藝為：70%乙醇、用量為10倍量、提取3次、每次1.5h。 繼而對(duì)大孔吸附樹脂分離富集有效部位的工藝進(jìn)行了篩選及優(yōu)

5、化。澤瀉浸膏用一定量50%乙醇溶解后，上樣于D型大孔吸附樹脂，充分吸附后，再用一定量 1華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文蒸餾水，30%乙醇，90%乙醇依次洗脫，收集90%乙醇洗脫液，蒸干溶劑，干燥，即為所得。以23-乙酰澤瀉醇B為對(duì)照品計(jì)算，富集產(chǎn)物中總?cè)祁惡靠蛇_(dá)50%以上，23-乙酰澤瀉醇B含量可達(dá)1.290%以上。實(shí)驗(yàn)表明：D型大孔吸附樹脂適合分離純化澤瀉中極性較小的三萜類成分。4、探討中藥澤瀉總?cè)朴行Р课辉隗w外對(duì)草酸鈣結(jié)晶形成的影響，并初步確定其抑制草酸鈣結(jié)石形成的有效部位。應(yīng)用種晶技術(shù)檢測(cè)澤瀉不同濃度的總?cè)铺崛∥镌隗w外對(duì)一水草酸鈣晶體生長(zhǎng)指數(shù)（I.I）。結(jié)果表明澤

6、瀉總?cè)平喔?、低劑量組的草酸鈣晶體生長(zhǎng)抑制指數(shù)高達(dá)87.75%。中藥澤瀉總?cè)铺崛∥锬苊黠@抑制草酸鈣晶體的生長(zhǎng)，是澤瀉抑制草酸鈣結(jié)石形成的有效部位，對(duì)該部位的有效化學(xué)活性成分有待于進(jìn)一步的研究。【關(guān)鍵詞】：澤瀉；23-乙酰澤瀉醇B；總?cè)?；含量測(cè)定；分光光度法；大孔吸附樹脂；草酸鈣晶體；種晶技術(shù)2華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文AbstractObjective: Based on the early pharmacology experiments. Total triterpenes was identified to be effective fractions of A

7、lisma orientalis preliminary.Macroporous resin was used in separation and purification of the total triterpenes of Alisma orientalis, the content of total triterpenes in the effective fractions reached More than 50 percent. And Alisol B 23-acetate was chose as evaluation index and its amount reached

8、 1.29 percent and above.And the Anti-urinary tract stones effect of effective fractions was studied in vitro.Methods and results: A new method was established for the determination of total triterpenes from the effective fractions of Alisma orientalis. Total triterpenes was measured by spectrophotom

9、eter with 5% vanillin-glacial acetic acid solution and perchloric acid as color-developing agent and detected at 554 nm wavelength. The calibration curve was linear (r=0.9996) in the range of 23.8142.8ug and the curve was Y=0.0055x-0.0512.The experiment showed that the spectrophotometer was suitable

10、 for the determination of total triterpenes from Alisma orientalis.A new method was established for the determination of Alisol B 23-acetate from the effective fractions of Alisma orientalis. The content of Alisol B 23-acetate was measured by HPLC-ELSD. The experiment showed that the calibration cur

11、ve was linear in the range of 0.1384ug0.6920ug and the curve was Y=494467X-4426.9,r=0.9999. The results of the experiments of accuracy、reproducibility and stability were good.The observation of the extracted term of the effective fractions of Alisma orientalis 3華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文with the amount

12、 of Alisol B 23-acetate as evaluation index gave the result that the best extracted term was that Alisma orientalis was extracted by 70% alcohol for three times, each time last for 1.5h. The volume of alcohol was ten times of the medicinal substances each time. In several kinds of macro absorption r

13、esins, conclusion was reached that the A resin was the best and the best technology term was that First, the extractum of Alisma orientalis was dissolved by a certain amount of 50% ethanol solution and then the sample was fully adsorpted by the HPD-100 macro absorption resin; Second, a certain amoun

14、t of distilled water, 30% ethanol, 90% ethanol was used to elute the sample in order. Then, the eluting of 90% ethanol solution was collected. Solvent was evaporated. Dried and then the residues was collected. Alisol B 23-acetate was used as an evaluation index and gave the result that the concentra

15、tion of total triterpenes reached up to 50 percent, and the concentration of Alisol B 23-acetate also reached up to 1.29 percent. Experiments showed that: HPD-100 macro resin was suitable for isolation and purification of triterpenoid compounds which polarity was weak in Alisma orientalis.To study t

16、he effect of total triterpenes of Alisma Orientalis on calcium oxalate crystal formation in vitro and to identify the effective constituents. We detected the growth index (I.I) of calcium oxalate crystal by a seeded crystallization technique. Both the high and low dose of total triterpenes can reduc

17、e the growth index of crystallization reach 87.75%. The total triterpenes of Alisma Orientalis seems to inhibit significantly calcium oxalate crystal formation in vitro and to be the effective constituent of Alisma Orientalis.Key words: Alisma Orientalis(Sam.)Juzep.; Alisol B 23-acetate; Total trite

18、rpenes; Content determination; Spectrophotometer; Macro absorption resin; Calcium oxalate crystal; Seeded crystallization technique4華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文前 言泌尿系結(jié)石，是威脅人類健康的常見疾病之一，其中絕大多數(shù)是草酸鈣結(jié)石。隨著體外沖擊波碎石術(shù)等現(xiàn)代高科技技術(shù)的臨床應(yīng)用，泌尿系結(jié)石的治療已取得較大的進(jìn)步，但泌尿系結(jié)石被摘除或排出后復(fù)發(fā)率很高，達(dá)6080。研究發(fā)現(xiàn)，目前治療泌尿系結(jié)石及預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥物，如枸櫞酸鉀、磷酸纖維素鈉、正磷酸鹽、

19、噻嗪類藥物等，臨床療效不滿意，而且副作用較大。澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis (Sam.) Juzep.的干燥塊莖。性寒,味甘、淡。入腎、膀胱經(jīng)。味甘、淡,可滲濕,性寒能瀉腎及膀胱之熱, 為常用的利水、滲熱、瀉熱藥物。 臨床上常用于小便不利、水腫脹滿、泄瀉尿少、痰飲眩暈、熱淋澀痛、高血脂癥等的治療。澤瀉可與多種中草藥配伍組成多種方劑，如金龍排石湯、豬苓湯、五苓散等，用于泌尿系結(jié)石的治療。但是對(duì)于澤瀉單味藥材應(yīng)用于泌尿系結(jié)石方面治療的研究報(bào)道較少。近年來(lái)，對(duì)澤瀉的化學(xué)成分研究表明：澤瀉中含有系列三萜類澤瀉醇A、B、C , 24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰

20、澤瀉醇C等和系列倍半萜類(orientalol A、B、C、D 等) 以及揮發(fā)油、生物堿、天門冬素、脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸)、樹脂、蛋白質(zhì)、淀粉等成分。其中三萜類化合物澤瀉醇A、B、C 和24-乙酰澤瀉醇A、23-乙酰澤瀉醇B、24-乙酰澤瀉醇C具有利尿、降血脂、抗脂肪肝及保肝作用，為澤瀉的主要活性成分。此后,各國(guó)學(xué)者又從不同產(chǎn)地、不同加工方法的澤瀉原料中分離得到了30多個(gè)三萜類化合物,其結(jié)構(gòu)多為原萜烷型(Protostane) 四環(huán)三萜。從生物途徑來(lái)歸納,它們均由新鮮植物中含量很高的23-乙酰澤瀉醇B (Alisol B 23-acetate) 衍生而來(lái)。澤瀉中三萜醇酮的結(jié)構(gòu)如

21、下：5華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文在日本，自1980 年八竹和粟田等報(bào)告豬苓湯具有治療泌尿系結(jié)石的作用以來(lái)，豬苓湯就成為了臨床預(yù)防和治療尿石癥的常用藥物之一。此后，陸續(xù)有學(xué)者對(duì)豬苓湯治療尿石癥的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。1985 年小川等發(fā)現(xiàn)豬苓湯可降低尿液中草酸排泄量和腎組織草酸含量而抑制大白鼠實(shí)驗(yàn)性腎結(jié)石的形成。Utsunmiya 等對(duì)組成豬苓湯的單味中藥進(jìn)行逐一篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)澤瀉水提取液在濃度為5mg / ml時(shí)，體外能明顯抑制草酸鈣結(jié)晶的生長(zhǎng)和聚集，聚集抑制指數(shù)（Ia）大于80%，生長(zhǎng)抑制指數(shù)（Ig）大于90%。Kawamura 等研究表明，在稀釋的尿液中，澤瀉水提取物濃度

22、在10mg / ml 時(shí)有強(qiáng)烈的抑制草酸鈣生長(zhǎng)6華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文和聚集作用，而在未稀釋的亞穩(wěn)尿液中，澤瀉水提取物濃度在0.1 1.0mg / ml 時(shí)，即有抑制作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)澤瀉水提取物中不含有萄胺聚糖類物質(zhì)，但是其中所含分子量大于10，000 的大分子物質(zhì)有強(qiáng)烈的抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)和聚集作用。Yamaguchi等發(fā)現(xiàn)澤瀉水提取液在大鼠體內(nèi)能明顯降低腎組織鈣含量和抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性腎結(jié)石的形成。另外，研究還發(fā)現(xiàn)澤瀉對(duì)草酸和鈣的代謝沒有影響，推測(cè)其主要在結(jié)石形成過(guò)程中阻止草酸鈣結(jié)晶生長(zhǎng)和聚集。在國(guó)家自然科學(xué)基金資助下（No: 39970891），尹春萍等對(duì)澤瀉防治泌尿系

23、結(jié)石的有效部位進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)澤瀉用70%乙醇提取的提取液經(jīng)乙酸乙酯萃取后所得到的乙酸乙酯部位在體外實(shí)驗(yàn)中能明顯抑制尿草酸鈣結(jié)晶的生長(zhǎng)和聚集，體內(nèi)能明顯降低腎鈣含量和減少腎小管內(nèi)草酸鈣結(jié)晶形成。同時(shí)，曹正國(guó)等應(yīng)用現(xiàn)代植化方法澤瀉乙酸乙酯部位進(jìn)行進(jìn)一步分離提取，得到3種化學(xué)成分，這3種化學(xué)成分在體外對(duì)尿草酸鈣結(jié)石形成有明顯的抑制作用，其中，化學(xué)成分對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，且該抑制作用在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間、劑量依賴性,其結(jié)構(gòu)經(jīng)初步鑒定主要為類化合物。綜合大量文獻(xiàn)，我們得出澤瀉萜類化學(xué)成分可能是澤瀉抑制尿草酸鈣結(jié)石形成的活性部位的結(jié)論。該部位的有效活性成分有待于更深入的研究。7華 中 科 技 大

24、 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文第一部分 澤瀉實(shí)驗(yàn)研究第一章 澤瀉有效部位總?cè)频暮繙y(cè)定1.1 儀器與試藥儀 器：紫外-可見光分光光度計(jì)（UV-cary2000）電子分析天平（精確至十萬(wàn)分之一：AG285，METTLER TOLEDO） RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠）SHZ-D（）循環(huán)水真空泵（上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司） AS2060B型超聲波清洗儀（Automatic Science Instrument Co. Ltd） DZF-6020型真空干燥箱（上海索譜儀器有限公司）HH-4型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市陽(yáng)光儀器廠）對(duì)照品：23-乙酰澤瀉醇B（由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供1）

25、。經(jīng)HPLC峰面積歸一法確認(rèn)其純度大于98%，符合含量測(cè)定要求。藥 材：澤瀉（購(gòu)于武漢市漢口國(guó)藥有限公司，安徽亳州產(chǎn)。經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室尹春萍教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉(Alisma orientalis (Sam.) Juzep .)的干燥塊莖）；試 劑：甲醇，乙醇，乙酸乙酯，高氯酸，冰醋酸，香草醛等試劑為分析純。乙腈為色譜純。1.2 對(duì)照品和供試品溶液的制備1.2.1 對(duì)照品溶液的制備23-乙酰澤瀉醇B為從澤瀉中分離得到的化合物，該成分在澤瀉藥材中含量較高且較穩(wěn)定，符合對(duì)照品要求。本對(duì)照品經(jīng)峰面積歸一法純度測(cè)定表明：其純度大于98%，符合含量測(cè)定要求。8華 中 科 技

26、大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 圖 1.1-1 對(duì)照品 HPLC 歸一化法純度測(cè)定色譜圖 精密稱取 23-乙酰澤瀉醇 B 對(duì)照品 5.950mg， 溶于無(wú)水乙醇中定容至 50ml， 得對(duì)照品溶液，濃度為 0.1190mg/ml，搖勻，備用。 1.2.2 供試品溶液的制備 稱取澤瀉粗粉 20g,加入 10 倍量 70%的乙醇，回流提取三次，每次為 1.5h。 過(guò)濾，合并濾液，回收溶劑至浸膏狀，加入 100ml 水分散，分別用 100ml 水飽 和的乙酸乙酯萃取 3 次，合并萃取液，回收溶劑得浸膏，干燥。將浸膏用 300ml50%乙醇溶解。備用，作為供試品。 1.3 1.3.1 方法學(xué)認(rèn)證實(shí)驗(yàn) 測(cè)

27、定波長(zhǎng)的選擇 分別取一定量的 23-乙酰澤瀉醇 B 對(duì)照品溶液和供試品溶液加顯色劑后 （同 標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法） ，于紫外-可見光分光光度計(jì)上掃描，兩者均在 550nm 附近 有一吸收峰且空白對(duì)照無(wú)干擾，綜合兩者圖譜，確定 554nm 為測(cè)定波長(zhǎng)2-5。 9 華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文圖1.3-1 對(duì)照品溶液全波長(zhǎng)掃描圖譜 圖1.3-2 供試品溶液全波長(zhǎng)掃描圖譜1.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)和測(cè)定波長(zhǎng)的確定取對(duì)照品溶液和供試品溶液分別為0.2ml，0.1ml。按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法，依法顯色后，分別在0120min內(nèi)測(cè)定，對(duì)照品溶液和供試品溶液均在1530min內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為0.1

28、8%，0.06%；30min后穩(wěn)定性開始下降。表明：該方法測(cè)定需在顯色后1530min內(nèi)完成。另取兩份對(duì)照品和供試品溶液，依法顯色后在1530min內(nèi)重新掃描波長(zhǎng)，確定波長(zhǎng)依然為554nm。1.3.3 顯色劑使用條件的選擇1.3.3.1 5%香草醛-冰醋酸用量考察分別精密吸取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品溶液和供試品溶液各5份于具塞試管中，每份分別為0.2ml,0.1ml。水浴蒸干后各加5%香草醛-冰醋酸0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml，然后各加高氯酸0.8ml，于60水浴加熱中15min。取出置冰水中冷卻后，加乙酸乙酯5ml,搖勻室溫放置10min后，在554nm處測(cè)定吸收值，結(jié)果見表1

29、.3-1。表1.3-1 不同香草醛用量結(jié)果 5%香-冰V/ml對(duì)照品Ab供試品Ab 結(jié)果顯示：0.3ml5%香草醛-冰醋酸為最佳用量。10華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 1.3.3.2 高氯酸用量考察分別精密吸取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品溶液和供試品溶液各5份于具塞試管中，每份分別為0.2ml,0.1ml。水浴蒸干后各加5%香草醛-冰醋酸0.3ml，再分別加高氯酸0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml，于60水浴加熱中15min。取出置冰水中冷卻后，加乙酸乙酯5ml,搖勻室溫放置10min后，在554nm處測(cè)定吸收值，結(jié)果見表1.3-2。表1.3-2 不同高氯酸用量結(jié)果 高氯

30、酸V/ml對(duì)照品Ab供試品Ab 結(jié)果顯示：1.0ml高氯酸為最佳用量。1.3.3.3 水浴溫度考察分別精密吸取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品溶液和供試品溶液各5份于具塞試管中，每份分別為0.2ml,0.1ml。同上法分別在50，60，70，80，90測(cè)定吸光度值，結(jié)果見表1.3-3。表1.3-3 不同水浴溫度考察結(jié)果水浴溫度T/對(duì)照品Ab供試品Ab 結(jié)果顯示：隨溫度升高，吸收值增加且變得不穩(wěn)定，且超過(guò)60空白顯色劑開始變色，故本文選擇水浴溫度為60。1.3.3.4 水浴時(shí)間的選擇分別精密吸取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品溶液和供試品溶液各5份于具塞試管中，每份分別為0.2ml,0.1ml。同上法分別在水浴

31、10，15，20，25，30min條件下測(cè)定吸光度值，結(jié)果見表1.3-4。11華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 表1.3-4 不同水浴時(shí)間考察結(jié)果 水浴時(shí)間t/min對(duì)照品Ab供試品Ab 10 15 20 25 結(jié)果表明，水浴時(shí)間20min為最佳。1.3.3.5 結(jié)論：應(yīng)用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定澤瀉三萜類化合物含量時(shí)，優(yōu)選的顯色條件為：加入0.3ml5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0ml高氯酸，水浴溫度為 60，水浴時(shí)間為20min。1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取上述對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，分別置于具塞試管中，水浴揮去溶劑，冷卻，準(zhǔn)確加入

32、0.3ml5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0ml高氯酸，混勻，密塞。置60恒溫水浴中加熱20min，取出，冰水浴冷卻，加乙酸乙酯5ml，搖勻，室溫放置10min后，在554nm處測(cè)定吸光度，以試劑為空白。以吸光度為縱坐標(biāo)，23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品微克數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.0055x-0.0512，r=0.9996，線性范圍為23.8142.8ug。表1.3-5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 序號(hào) 加入對(duì)照品量(ug) 吸光度（Ab）-0.0512 0.9996 56119 142.8 0.0055 0.5971 0.752212華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文1.3.5 精密度考察精

33、密吸取同一對(duì)照品溶液5份于具塞試管中，體積分別為0.1ml。顯色后依法測(cè)定，RSD為0.4860%。見表1.3-6。表1.3-6 精密度考察實(shí)驗(yàn) 序號(hào) 對(duì)照品Ab 對(duì)照品Ab平均值RSD(%)0.486 0.10591.3.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一澤瀉供試藥材各5份，按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作。并依法顯色后測(cè)定吸光度值，RSD為1.03%。13華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文表1.3-7 重現(xiàn)性考察實(shí)驗(yàn)序號(hào)供試品Ab供試品Ab平均值RSD(%)1.031.14221.3.7 回收率測(cè)定精密吸澤瀉粗粉30g各7份，1份未加入對(duì)照品溶液，作為空白對(duì)照，其余6份分別加入對(duì)照品溶液（0.11

34、90mg/ml）1.0ml，按供試品制備項(xiàng)下操作。依法測(cè)定，結(jié)果見表1.3-8。表1.3-8 回收率試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）加入對(duì)照測(cè)得含總?cè)频幕厥章势骄厥誖SD品的量/ug 量/ug （%）率（%） （%）119.0 97.03119.0119.0119.0其中,M0為未加對(duì)照品的樣品中測(cè)得的總?cè)频馁|(zhì)量編號(hào)吸光度Ab空白 1 2 3 4 5 6 0.5709 1.200 1.216 1.208 1.195 1.213 1.1931.231%14華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文第二章 澤瀉有效部位中23-乙酰澤瀉醇B的含量測(cè)定2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試藥儀 器：紫外-可見光分光光度計(jì)

35、（UV-cary2000）電子分析天平（精確至十萬(wàn)分之一：AG285，METTLER TOLEDO） RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市英峪予華儀器廠）SHZ-D（）循環(huán)水真空泵（上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司） AS2060B型超聲波清洗儀（Automatic Science Instrument Co. Ltd） DZF-6020型真空干燥箱（上海索譜儀器有限公司）HH-4型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市陽(yáng)光儀器廠）高效液相色譜儀（日本日立公司）；Alltech ELSD2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；色譜柱為HypersilODS25umC18柱（250mm*4.6mm）；25ul進(jìn)樣器,四元泵，T20

36、00色譜工作站；一次性濾器（0.45um）；水為純凈水（娃哈哈）。對(duì)照品：23-乙酰澤瀉醇B（由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供）。經(jīng)HPLC峰面積歸一法確認(rèn)其純度大于98%，符合含量測(cè)定要求。藥 材：澤瀉（購(gòu)于武漢市漢口國(guó)藥有限公司，安徽亳州產(chǎn)。經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室尹春萍教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉(Alisma orientalis (Sam.) Juzep .)的干燥塊莖）；試 劑：甲醇，乙醇，乙酸乙酯，高氯酸，冰醋酸，香草醛等試劑為分析純。乙腈為色譜純。2.2 對(duì)照品和供試品溶液的制備2.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取于60干燥至恒重的對(duì)照品23-乙酰澤瀉醇B3.460 mg，置5

37、ml 15華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 容量瓶中，加乙腈定容至刻度，濃度為0.6920mg/ml。精密吸取此溶液20ul，40ul，60ul，80ul，100ul于2ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45um濾膜，分別配成0.00692mg/ml，0.01384mg/ml，0.02076mg/ml，0.02768mg/ml，0.0346mg/ml的系列對(duì)照品溶液。2.2.3 供試品溶液的制備將澤瀉粉碎成粗粉, 稱取20g,加入10倍量70%的乙醇，回流提取三次，每次為1.5h。提取完畢，過(guò)濾，合并濾液，取部分用微孔濾膜(0.45um ) 濾過(guò)，注入高效液相色譜儀，測(cè)定

38、澤瀉醇B23-乙酸酯的含量。余下部分揮干溶劑，干燥，稱重，計(jì)算澤瀉醇B23-乙酸酯占浸膏的比例。2.3 色譜條件色譜柱：HypersilODS25umC18色譜柱（250mm*4.6mm）；流動(dòng)相：乙腈-水（92：08）；流 速：1.00ml/min；漂移管T：82；N2流速：2.0L/min；實(shí)驗(yàn)證明在上述色譜條件下，供試品溶液中23-乙酰澤瀉醇B能與其他色譜峰得到很好分離，見圖2.3-1。圖2.3-1 供試品溶液的HPLC圖譜16華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 2.4 方法學(xué)認(rèn)證實(shí)驗(yàn)2.4.1 流動(dòng)相、流速、漂移管溫度及N2流速的選擇2.4.1.1 流速的選擇流動(dòng)相、流速、

39、漂移管溫度及N2流速均對(duì)流速有很大的影響，乙腈比例越大，流速越快，漂移管溫度越高，N2流速越大，出峰越快，但是同時(shí)對(duì)柱子造成的壓力也相應(yīng)加大，影響柱子壽命；而且出峰過(guò)快，容易造成部分峰重疊，不能反映樣品成分的真實(shí)情況，影響計(jì)算。為避免流動(dòng)相流速過(guò)大造成柱子壓力過(guò)高，選定流速為1.0ml/min。2.4.1.2 流動(dòng)相、漂移管溫度及N2流速的選擇根據(jù)ELSD軟件，針對(duì)不同比例的流動(dòng)相，系統(tǒng)提供相應(yīng)的漂移管溫度以及N2流速參考值，按照參考值設(shè)定ELSD檢測(cè)器，得到相應(yīng)得23-乙酰澤瀉醇B峰的保留時(shí)間。表2.4-1 ELSD 2000 Control軟件 乙腈-水：漂移管溫度參考值N2流速參考值保留

40、時(shí)間（T） 2.1 2.0 2.0 1.9 1.8 綜合考慮峰形和經(jīng)濟(jì)成本，決定選用流動(dòng)相比例為乙腈-水（92：08），并對(duì)系統(tǒng)提供的漂移管溫度以及N2流速參考值作相應(yīng)調(diào)整，確定漂移管溫度為82，N2流速為2.0L/min。2.4.2 線性范圍考察分別精密取上述系列濃度對(duì)照品溶液各20ul進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:Y=494467X-4426.9,r=0.9999。結(jié)果顯示澤瀉醇B23-乙酸酯在0.1384ug0.6920ug之間有良好的線性關(guān)系。見圖2.4-1，表2.4-2。17華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué)

41、 位 論 文表2.4-2 HPLC法測(cè)定23-乙酰澤瀉醇B含量的線性范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號(hào)進(jìn)樣量(ug)峰面積-4426.90.99994944672.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)同一對(duì)照品溶液（濃度為0.6920mg/ml），隔2h測(cè)1次，每次進(jìn)樣20ul。結(jié)果表明，供試液中23-乙酰澤瀉醇B在12h內(nèi)穩(wěn)定。其峰面積RSD為2.43%。見表2.4-3。表2.4-3 23-乙酰澤瀉醇B的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 時(shí)間(h)進(jìn)樣量(ul)峰面積峰面積平均值RSD(%)2.439981872 18華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在8小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。 2.4.4 精密度考察試驗(yàn)按照最佳工藝制

42、備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.04%。見表2.4-4。表2.4-4 精密度考察試驗(yàn)結(jié)果序號(hào)進(jìn)樣量(ul)峰面積峰面積平均值RSD(%)1.04284820 試驗(yàn)結(jié)果表明，精密度良好。2.4.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)分別取同一批樣品的澤瀉粗粉20g，按照供試品溶液的制備方法，平行操作5份，依法測(cè)定，結(jié)果23-乙酰澤瀉醇B的平均含量為0.01840%，RSD為2.50%。見表2.4-5。表2.4-5 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果 序號(hào)進(jìn)樣量(ul)峰面積峰面積平均乙酰澤瀉醇B平均含量（%）0.01840RSD(%)2.50華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文2.4.6 回收率試驗(yàn)精密稱取澤瀉粗粉約20g，共7份，1份未加入