第二篇第十二章生物信息學(xué)在分子診斷中的應(yīng)用

1、第二篇技術(shù)篇第十二章生物信息學(xué)在分子診斷中的應(yīng)用第一節(jié)生物信息學(xué)概論一、生物信息學(xué)的定義生物信息學(xué)是結(jié)合了生物學(xué)和信息技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)，分析海量的并且還在快速積累的生物數(shù)據(jù)，從中獲取生物科學(xué)新知識(shí)的一門新的交叉科學(xué)。人類基因組計(jì)劃的意義人類基因研究的意義在于它可以支持和推動(dòng)生命科學(xué)中一系列重要的基礎(chǔ)性研究。如基因組遺傳語言的破譯，基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，生命的起源和進(jìn)化，細(xì)胞發(fā)育、生產(chǎn)、分化的分子機(jī)理，疾病發(fā)生的機(jī)理等。為推動(dòng)醫(yī)學(xué)長足進(jìn)步帶來前所未有的機(jī)遇，基因診斷、基因療法和基因藥物的開發(fā)，有可能成為未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要分支。人類基因組計(jì)劃的進(jìn)一步成功將促進(jìn)生命科學(xué)與信息科學(xué)、材料科

2、學(xué)的融合，從而帶動(dòng)一批高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展二、生物信息學(xué)研究的范疇第一、各種生物數(shù)據(jù)庫的建立和管理；第二、研究高效率的統(tǒng)計(jì)工具，分析算法，發(fā)展方便、快捷的分析程序；第三、從海量的原始生物數(shù)據(jù)中發(fā)掘新知識(shí)。第二節(jié)計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)一、計(jì)算機(jī)常識(shí)：硬件和軟件計(jì)算機(jī)的主要硬件由中央處理器（CPU）、存儲(chǔ)器、輸入設(shè)備和輸出設(shè)備組成。常用的操作系統(tǒng)：windows、UNIX、Linux二、互聯(lián)網(wǎng)和常用搜索引擎WWW是WorldWideWeb的縮寫，即通常我們所說的國際互聯(lián)網(wǎng)，它的每個(gè)節(jié)點(diǎn)在邏輯上都與任何其他節(jié)點(diǎn)保持聯(lián)系，可以相互交換信息。三、文件的壓縮和解壓傳輸或保存較大的數(shù)據(jù)時(shí)，常對(duì)文件進(jìn)行壓縮，以減少數(shù)據(jù)量

3、。特別是對(duì)于圖形文件，壓縮尤其重要。在UNIX或Linux系統(tǒng)中，壓縮命令是compressmyfile,壓縮后的文件自動(dòng)加上后綴.Z。解壓縮命令是uncompressmyfile.Z。PC機(jī)上的Windows操作系統(tǒng)沒有標(biāo)準(zhǔn)的壓縮和解壓軟件，但網(wǎng)上有許多針對(duì)Windows的免費(fèi)或代免費(fèi)試用期的壓縮軟件，如FreeZip、WinZip等四、文件和數(shù)據(jù)的傳送用戶需要遞交一條或多條核酸或蛋白質(zhì)序列去做數(shù)據(jù)庫查詢或比對(duì)。這時(shí)常用的方法有：使用視窗系統(tǒng)的剪切、復(fù)制和粘貼的功能.對(duì)于不太長的序列，這種方法比較方便；網(wǎng)頁的輸入窗口旁常有一個(gè)“瀏覽目錄”按鈕，點(diǎn)擊該按鈕，會(huì)彈出一個(gè)對(duì)話框，找到需要上傳的序列

4、文件，再按“提交”鈕完成遞交。用這種方法可以一次遞交較長的序列；有些大型信息中心和研究單位還有遠(yuǎn)程文件傳送服務(wù)，即遵從文件傳輸協(xié)議(filetransferprotocol，ftp)的服務(wù)器地址，用戶可以無記名的方式訪問公用的目錄，讀取文件，下載軟件或數(shù)據(jù)。五、編程和語言在眾多的計(jì)算機(jī)語言中，C語言無疑是最常用的，它具有代碼精煉，執(zhí)行效率高的特點(diǎn)，網(wǎng)上還有大量的現(xiàn)成模塊供免費(fèi)使用。對(duì)于非計(jì)算機(jī)專業(yè)人員，還可以選擇VisualBASIC（VB）1/5語言。VB語言具備了高級(jí)語言的特點(diǎn)，語句結(jié)構(gòu)類似自然語言，對(duì)于生物背景的專業(yè)人員可能較容易掌握。如果在研究中大量使用網(wǎng)絡(luò)資源，則需要掌握一定的網(wǎng)絡(luò)編

5、程語言，例如：Perl語言、PHP語言和JAVA語言等。第三節(jié)數(shù)據(jù)的獲得DNA、RNA、蛋白質(zhì)的測序蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)數(shù)據(jù)蛋白質(zhì)相互作用一、DNA、RNA和蛋白質(zhì)的測序基因組DNA直接來源于細(xì)胞核基因組，它的組成包括基因和基因間區(qū)域，基因序列中還包括內(nèi)含子和外顯子。cDNA是由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來，全長cDNA應(yīng)該包括5端非編碼區(qū)，3端的多聚腺苷酸序列和編碼序列。重組DNA序列是基因重組到質(zhì)粒、病毒和cosmid等載體后經(jīng)測序得到的DNA序列。RNA的序列可以從基因組序列或cDNA序列推導(dǎo)出來；直接的RNA測序涉及修飾核苷酸的識(shí)別，可通過質(zhì)譜分析獲得。蛋白質(zhì)的序列可以通過DNA序

6、列推導(dǎo)而來，但從DNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列不能反應(yīng)真實(shí)的蛋白質(zhì)序列情況，蛋白質(zhì)測序主要依靠質(zhì)譜分析(massspectrometry,MS)技術(shù)，基本原理是通過準(zhǔn)確測定真空中的離子質(zhì)量或電荷量來測算出分子組成。二、蛋白結(jié)構(gòu)的分析X射線晶體學(xué)技術(shù)：通過研究X射線對(duì)蛋白質(zhì)晶體的掃描后產(chǎn)生的衍射模式來測定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；核磁共振譜法(NMR)spectroscopy)：該方法常用于較?。?lt;25kDa）的，可溶性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定；有些蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，不能用X射線晶體學(xué)技術(shù)測定，又太大而不能用核磁共振譜技術(shù)測定，其它技術(shù)方法：X射線纖維衍射技術(shù)；電子顯微鏡(electronmicroscopy)；環(huán)

7、形雙色色譜技術(shù)(circulardichroism(CD)spectroscopy)三、基因和蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)表達(dá)文庫的測序基因表達(dá)連續(xù)分析技術(shù)（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）DNA芯片雙向電泳分析技術(shù)（2Dgelelectrophoresis）四、蛋白質(zhì)相互作用1、遺傳學(xué)方法：2、親和性方法：親和色譜法（Affinitychromatography）免疫共沉淀法(coimmunoprecipitation)免疫共沉淀基本原理:細(xì)胞裂解液中加入抗體，與抗原形成特異免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗脫，收集免疫復(fù)合物，然后進(jìn)行SDS-PAGE及Westernblottin

8、g分析。3、分子和原子法：X射線晶體法和核磁共振法4、基于文庫法：酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybrid(Y2H)system）2/5第四節(jié)生物信息數(shù)據(jù)庫一、重要生物信息中心美國國家信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)的GenBank(/web/GenBank/index.html);歐洲分子生物學(xué)室驗(yàn)室(EuropeanMolecularBiologyLaboratory-EuropeanBioinformaticsInstitute,EMBL-EBI)的EMBL(h

9、ttp:/www.ebi.ac.uk/databases/index.html);日本DNA數(shù)據(jù)庫(DNADataBankofJapan,DDBJ)(http:/www.ddbj.nig.ac.jp/)最重要的蛋白質(zhì)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫是瑞士的SWISS-PROT(/sprot/);蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PIR(ProteinInformationResource),包含所有序列已知的自然界中野生型蛋白質(zhì)的信息();PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫：收集由X射線衍射和核磁共振技術(shù)測定的蛋白質(zhì)大分子三維結(jié)構(gòu)(http:/www.rcs

10、/pdb)二、數(shù)據(jù)庫檢索工具Entrez檢索工具：Entrez是美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）提供的集成檢索工具/Entrez/SRS（SequenceRetrievalSystem）檢索工具：是歐洲分子生物學(xué)網(wǎng)EMBnet的主要數(shù)據(jù)庫檢索工具，可以從EMBnet的主頁進(jìn)入。DBGET/LinkDB檢索工具：是日本京都工具大學(xué)建立的GenomeNet數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫主要針對(duì)代謝途徑。http:/www.genome.ad.jp/dbget/dbget_manual.html。二、數(shù)據(jù)庫檢索工具第五節(jié)核酸序列分析一、核酸序列的基

11、本分析核酸序列的分子量、堿基組成、堿基分布等基本分析：BioEdit(/BioEdit/bioedit.html)DNAMAN(限制性酶切分析：限制性酶數(shù)據(jù)庫(RestrictionEnzyme(;測序峰圖的查看、核實(shí)與修改:Chromas,BioEdit,DNAMAN測序結(jié)果需要識(shí)別與去除測序時(shí)使用的載體序列：VecScreen(/VecScreen.html)DataBase,REBASE)EST序列進(jìn)行電子延伸：將待分析的核酸序列（稱為種子序列）采用Blast軟件搜索GenBank的EST數(shù)

12、據(jù)庫，獲得與種子序列有較高同源性的EST序列，一般要求在重疊40個(gè)堿基范圍內(nèi)有95以上的同源性，稱匹配序列；將匹配序列與種子序列裝配成新序列，即片段重疊群分析(contiganalysis)；再以新產(chǎn)生的序列為種子序列，重復(fù)上述過程，直至沒有新的匹配序列為止。對(duì)核酸序列進(jìn)行電子基因定位：利用序列標(biāo)簽位點(diǎn)(SequenceTaggedSite,STS);利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因電子定位;直接利用基因組序列進(jìn)行基因電子定位。二、核酸序列的比對(duì)分析和功能預(yù)測BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）是基本局域聯(lián)配搜索工具；Blast功能有：FASTA：根據(jù)用戶提

13、交的單個(gè)序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索比對(duì)的程序。3/5網(wǎng)上服務(wù)器和電子郵件服務(wù)：http:/www.ebi.ac.uk/mailto:fastaebi.ac.ukhttp:/www.fasta.genome.ad.jpmailto:fastanig.ac.jp進(jìn)行多序列聯(lián)配：ClustalW:http:/www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html/soft/molbio/align/clustal/ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/software/dos/clustalw。ClustalX:CluastalW程序

14、的UNIX版本，它使用X窗口圖形界面，ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/softwareftp:/ftp-igbmc.u-strassbg.fr/pub/clustalX。對(duì)聯(lián)配結(jié)果進(jìn)一步編輯，形成適于發(fā)表的形式，可用的軟件有：SeaView:ftp:/biom3.univ-lyon1.frBOXSHADE:/software/box_form.html)CINEMA:http:/www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/cinema2.1/cinema2hdr.html三、開讀框的分析GT-AG法則：外顯子與內(nèi)含子

15、之間的連接區(qū)序列高度保守，如大部分內(nèi)含子5端起始的兩個(gè)堿基是GT，3端最后兩個(gè)堿基是AG?；蜃R(shí)別軟件，常用的有：ORFFinder(/gorf/gorf.html)GRAIL(/grainbin/)GeneFinder(http:/genomic.sanger.ac.uk)Glimmer(/labs/compbio/glimmer.html/)GenScan(/genscan.html)GeneLang(http:/www

16、./genlang/)四、引物設(shè)計(jì)PrimerPremier軟件:Primer3軟件:/cgi-bin/primer/primer3Oligo、VectorNT、Omiga等五、向數(shù)據(jù)庫提交核酸序列向EMBL提交數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)表格可參見：http:/www.ebi.ac.uk/subs/emblsubs.tml向GenBank數(shù)據(jù)庫提交核酸序列可聯(lián)網(wǎng)進(jìn)/GenBank/index.html也可用Sequin軟件制作好序列提交文件，向NCBI發(fā)送E-mail(gb-s

17、)提交第六節(jié)蛋白質(zhì)序列分析一、蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)等方面的分析:OMIGA、DNAMAN、BioEdit、MacVector等，4/5蛋白質(zhì)疏水性分析：ProtScale，/cgi-bin/protscale.pl預(yù)測跨膜區(qū)：http:/genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0//software/TMPRED_form.htmlhttp:/www.emblheidelberg.de/services/sand

18、er/predictproteinftp:/ftp.biochem.ucl.ac.uk。預(yù)測信號(hào)肽：http:/genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP/蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位：http:/predict.sanger.ac.uk/nnpsl/二、蛋白質(zhì)功能預(yù)測磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)，特殊的結(jié)構(gòu)區(qū)（motif）的分析：PROSITE:/prosite/BLOCKS:/blocks/PFAM:http:/www.sanger.ac.uk/software/pfam/PESCAN:http:/www.isrec.isb-sib.ch/software/pfscanInterProScan:http:/www.ebi.ac.uk/interpro/scan.htmlSMART:http:/smart.embl-heidberg.de/三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB(ProteinDataBank):(