液相色譜的方法開發(fā)(一)分離方法-WatersLCSch

1、液相色譜的方法開發(fā)一分離方法 第一步干什么?想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品或有否類似 樣品的分析方法查文獻如CA(化學(xué)文摘儀器制造商的文獻如Waters對色譜柱有足夠的了解掌握分離機理自己開發(fā)方法充分了解您自己的樣品分析時要了解哪方面的情況靈敏度的要求有多高?樣品的本底是否很復(fù)雜?有多少組份要分析?對分析的精確度準確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗而要求方法容易使用? 分離時要了解哪方面的情況 要分離即制備的樣品量有多大?要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量?是否需要保持生物活性?對分離產(chǎn)物純度的要求有多高?純度或活性的鑒定如何完成?一般的具體步驟先用一根短的色譜柱用相對

2、較高的流速使用盡可能純度高的標準品先用高強度的洗脫液調(diào)節(jié)k 值改變保留值調(diào)節(jié)值改變選擇性調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度請記住 每次改變一個參數(shù)使用文獻方法色譜柱填料的種類品牌是否相同? 注意文獻方法的流動相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同需要調(diào)整流動相注意色譜柱的規(guī)格內(nèi)徑柱長 需要調(diào)整流速進樣量注意梯度條件 了解系統(tǒng)的滯后體積梯度色譜方法轉(zhuǎn)換如果沒有與文獻或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進樣量轉(zhuǎn)換流速長度內(nèi)徑進樣量初始初始現(xiàn)在現(xiàn)在初始=×=L D L D L D Load Load 22(內(nèi)徑流速初始現(xiàn)在初始=×=D D D F F 22(反相色譜的方法開發(fā)開發(fā)過程實例色譜條件 色譜

3、柱C184mm30mm 流動相乙腈/水不同的溶劑強度60/40 50/5040/60由強漸弱 流速2ml/min樣品 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben 改變?nèi)萘恳蜃覭' 60/4050/5040/60譜圖改變選擇性通過改變流動相改變選擇性同樣強度的不同溶劑 改變色譜柱62:38/42:58/72:28/232 2OHCNCHOHMeOHOHTHF離子型化合物的分離方式 使用離子交換柱離子交換法主要用于強陰陽離子使用反相柱離子抑制色譜法通過改變流動相的pH值使樣品成中性離子對色譜法

4、加入對離子使樣品呈中性離子抑制色譜離子型化合物在反相色譜柱上不保留改變流動相的pH值抑制樣品離子的電離 適用于弱酸性化合物的分離降低流動相的pH值使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8較保險值3-7內(nèi)常用緩沖液及其pH值名稱pKaPhosphoric Acid 磷酸 2.12 (pKa1 Formic Acid 甲酸 3.75Succinic Acid 琥珀酸 4.19 (pKa1 Acetic Acid 乙酸 4.75Succinic Acid 琥珀酸 5.57 (pKa2 Phosphoric Acid 磷酸 7.21 (pKa2 Boric

5、 Acid 硼酸 9.24Phosphoric Acid 磷酸12.32 (pKa3離子抑制色譜實例在乙腈/水及pH=7時多數(shù)保留時間很短無法完全分離CHOOHOCH3COONa CHO COOHOCH3 1234離子抑制色譜的使用范圍如果 一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物反相柱在pH高于7時用離子抑制法使用離子對色譜法 在高pH值下用離子抑制色譜柱D18-613(聚合物基質(zhì)室溫 流動相乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA流速 1.0ml/min檢測UV-240nm樣品巴比妥的衍生物巴比妥 己瑣巴比妥 甲基苯

6、巴比妥 速可巴比妥 離子對色譜法 在反相色譜流動相內(nèi)加入離子對試劑與樣品中可電離的組份形成對離子在反相色譜柱上分離離子型化合物離子對試劑的類型PIC A磷酸季丁銨適用于弱酸PIC B烷基磺酸鹽適用于弱堿烷基長度不同形成對離子的能力不同通常有B5B6B7B8 PIC D4磷酸二丁胺適用于弱堿離子對色譜機理用離子對還是離子抑制中性物質(zhì)PIC A 酸性物質(zhì)PIC B 堿性物質(zhì)R SO 3H R C OH OR O S OH O O R OPOH O O R NH 2R 2N H R 3N (R 4N +-CH 3OH / 0.01M (NH 42HPO 4CH 3CN / H 2OCH 3OH /

7、H 2O磺酸染料苯甲酸馬來酸雌酮磷酸地塞米松氫化可的松對苯二甲酸二乙脂苊多巴胺VB2腎上腺素可待因潔爾滅離子抑制CH 3OH / 1%HAc CH 3CN / NaH 2PO 4離子對色譜的應(yīng)用 抗組胺及減充血劑藥物的分析使用五烷基磺酸鹽Packing: Packing: µBondapak Bondapak C C 18Column: Column: 4 mm ID x 30cm 4 mm ID x 30cmSolvent: Solvent: Methanol/H 2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Sulfonic Sulfonic Acid &

8、; 1% Acid & 1% Acid & 1% HOAc HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFS 1. 1. Maleic Maleic Maleic Acid Acid 2.2. Phenylephrine Phenylephrine 3. 3. Phenylpropanol Phenylpropanol Phenylpropanol-amine 4.4. Naphazoline Naphazoli

9、ne 5.5. Phenacetin Phenacetin 6.6. Pyrilamine Pyrilamine使用六烷基磺酸鹽Packing: µBondapak Bondapak C C 18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Sulfonic Sulfonic A c id & 1% & 1% HOAc HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV,

10、254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFS1. 1. Maleic Maleic Maleic Acid Acid2.2. Phenylephrine Phenylephrine Phenylephrine-HCl HCl3.3. Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine-HCl HCl4.4. Naphazoline Naphazoline Naphazoline-HCl HCl5.5. Phenacetin Phenacetin6. 6. Pyrilamine Maleate Pyrila

11、mine Maleate使用七烷基磺酸鹽1. 1. Maleic Maleic Maleic Acid Acid2.2. Phenylephrine Phenylephrine3.3. Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine4.4. Naphazoline Naphazoline5.5. Phenacetin Phenacetin6.6. Pyrilamine PyrilaminePacking: µBondapak Bondapak C C 18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water wit

12、h 0.005M HEPTANE Sul Sul f onic onic A c id & 1% & 1% HOAc HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFS樣品濃度對分析的影響0.02AU0.2AUPIC-B7的濃度很低為0.001M在樣品濃度較大時 如右圖第號峰由于PIC不足而分叉 離子對色譜分析水溶性維生素NCONH 2NH 3C HOCH 2OHCH 2OH NN NNH 3C H 3COO CH

13、 2CH CH CH HO HOHO CH 2O H NNH 3CNH 2CH 2NSCH 2CH 2OHCH 3 Cl -+1. Niacinamide 煙酰胺2. Pyridoxine 吡哆素 VB63. Riboflavin 核黃素 VB24. Thiamine 硫胺素VB 1用不同的離子對試劑 µBondaPak C18 3.9mm 300mm 溶劑 1.MeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC-B5 3.MeOH/H2O,PIC-B7/B5 色譜柱 1.如用PIC-B7 在 分開的情 況下 保留時間 太長 2.如用PIC-B5 峰 分不 開 3.如用PIC-B7 加B5 各組份 分開 且保留 時間合適 離子對色譜 - 水溶性維生素 保留時間與PIC試劑B之間的關(guān)系 36ml 保留體積 ml 胺 1 B (V 硫 核黃素(VB2 6 素(VB 吡哆 煙酰胺 4ml B5 50