免疫熒光雙標(biāo)法

1、免疫熒光雙標(biāo)記在心肌石蠟切片中的應(yīng)用 陳緒軍肖明第呂志前盧成寶薛松袁忠祥徐根興作者單位：200080 上海市第一人民醫(yī)院心血管外科 細(xì)胞性心肌塑型術(shù)（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治療受到人們越來越多的關(guān)注1，在證實移植的人干細(xì)胞在缺血/損傷的環(huán)境中分化為人心肌細(xì)胞方面，免疫熒光技術(shù)的運用逐漸增多，但多用的是新鮮冰凍切片，在石蠟心肌切片中應(yīng)用較少，而且多是單一抗原的熒光標(biāo)記2。有研究表明，酪胺信號放大( tyramide signal amplifications, TSA)技術(shù)可以提高反應(yīng)的靈敏性3。為此，我們以人心肌石蠟切片標(biāo)本為例

2、，運用TSA免疫熒光法與常規(guī)間接免疫熒光法分別對人心肌連接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）進(jìn)行標(biāo)記，旨在為心肌石蠟切片建立一個免疫熒光雙標(biāo)記的方法。一、材料與方法1. 主要試劑：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗體購自美國Chemicon 公司，標(biāo)記異硫氰酸酯熒光素（FITC）的驢抗兔多克隆IgG抗體與標(biāo)記有辣根過氧化物酶（HRP）的驢抗小鼠多克隆IgG抗體均購自美國Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43單克隆抗體、碘化丙啶(PI)與牛血清白蛋白（BSA）購自美國Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumria

3、n結(jié)合物試劑盒購自美國PerkinElmer公司。2標(biāo)本的取材、固定、切片及抗原修復(fù): 人心肌取自一例6歲先天性心臟病小孩右房耳，中性福爾馬林固定，4°C過夜固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，5 m石蠟切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟、梯度酒精浸泡后行抗原修復(fù)：浸入0.01 mol/L的檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中，95，浸泡30 min, 室溫冷卻10 min。3Cx-43的免疫熒光標(biāo)記：采用TSA-免疫熒光法4，按試劑盒說明書進(jìn)行。磷酸鹽緩沖液（PBS）室溫洗滌2次，每次5 min。置入3% 過氧化氫/甲醇溶液中，室溫，孵育10 min。再室溫PBS洗滌3次，每次5 min。 3%的BSA室

4、溫孵育30 min。加入小鼠抗人Cx-43單克隆IgG抗體，4孵育過夜。TnT緩沖液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐溫-20）室溫洗滌3次，每次5 min。加入標(biāo)記有HRP的驢抗小鼠IgG抗體，室溫孵育1 h。TnT液室溫洗滌3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：將酪氨-coumrian結(jié)合物加入放大緩沖液中配成酪胺-coumrian 工作液（150），避光，室溫孵育15 min。再次TnT液洗滌3次。4 Myosin的免疫熒光標(biāo)記：接上一步。采用間接免疫熒光法5。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗體（120

5、）， 37°C孵育1 h，PBS洗滌3次。加入標(biāo)記FITC的驢抗兔多克隆IgG抗體(1100)，避光，室溫孵育1 h。PBS室溫洗滌3次，每次5 min。5PI染細(xì)胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 g/ml），室溫避光孵育3 min。PBS室溫洗滌3次后甘油封片。6熒光顯微鏡觀察：運用帶有3通道的AX-80型Olympus 熒光顯微鏡鏡檢：綠通道中觀察FITC信號；藍(lán)通道中觀察coumrian信號；紅通道中觀察PI信號。圖像的編輯采用Advanced SPOT 軟件。二、結(jié)果在3通道的AX-80型Olympus 熒光顯微鏡中紅、綠、藍(lán)通道中分別可以觀察到PI、FITC及coumr

6、ian的信號，再經(jīng)Advanced SPOT 軟件疊加得到圖14，紅色代表PI標(biāo)記的人心肌細(xì)胞核，綠色代表FITC標(biāo)記的人心肌肌凝蛋白蛋白，藍(lán)色為coumrian標(biāo)記的人心肌Cx-43蛋白。圖1顯示為未加myosin抗體而加Cx-43抗體的人心肌石蠟切片; 圖2中均加myosin抗體與Cx-43抗體; 圖3中加myosin抗體而未加入Cx-43抗體；圖4均未加入 myosin抗體與Cx-43抗體。三、討論1.心肌石蠟切片的免疫熒光雙標(biāo)記： 在本研究中，圖1與圖2相比，人心肌石蠟切片中，不加myosin抗體的心肌纖維不著色，而加了myosin抗體的心肌纖維呈綠色，這表明心肌纖維被成功地標(biāo)記上抗人

7、myosin抗體，而且特異性高。Cx-43蛋白位于心肌細(xì)胞的周圍，在本研究中由圖1、圖2與圖3可以觀察到，加Cx-43抗體的人心肌Cx-43蛋白呈圖1人心肌石蠟切片未加肌凝蛋白抗體而加Cx-43抗體，PI復(fù)染×200圖2 人心肌石蠟切片均加肌凝蛋白抗體與Cx-43抗體，PI復(fù)染×200 圖3 人心肌石蠟切片加肌凝蛋白抗體而未加Cx-43抗體，PI復(fù)染×200圖4 人心肌石蠟切片均未加肌凝蛋白抗體與Cx-43抗體，PI復(fù)染×200 藍(lán)色，而未加Cx-43抗體的人心肌Cx-43蛋白不著色, 這表明心肌成功被標(biāo)記上抗人Cx-43抗體。圖2與圖4相比，

8、加入2種抗體，人心肌纖維 與 Cx-43蛋白均著色，而不加抗體者均不顯色；這說明本研究在人心肌石蠟切片中采用的免疫熒光雙標(biāo)記的方法是成功的，而且特異性高。在本研究中，標(biāo)記myosin 采用間接免疫熒光技術(shù)，這種方法較直接免疫熒光技術(shù)靈敏。在本研究中，兩種一抗分別來源于兔與小鼠，由于二抗是多克隆的，都可以與兩種一抗結(jié)合，故必須是先標(biāo)記Cx-43后再標(biāo)記myosin，不能將兩種二抗混合在一起加入，否則會出現(xiàn)交叉污染。2.本研究方法有以下優(yōu)點：（1）特異性較單熒光標(biāo)記強。在細(xì)胞性心肌塑型術(shù)中單熒光標(biāo)記有一定的假陽性率，而采用本研究的雙熒光法，能同時觀察到移植的人的干細(xì)胞表達(dá)兩種心肌抗原，假陽性率大大

9、減低。（2）目前，報道的人心肌免疫熒光雙標(biāo)記的方法較少，而且多需要特殊的設(shè)備如激光共聚焦掃描顯微鏡等7，本研究僅用普通的熒光顯微鏡就可以，易于掌握、使用方便。3心肌石蠟切片免疫熒光雙標(biāo)記的意義：成體心肌細(xì)胞再生能力非常弱6，移植干細(xì)胞到缺血/損傷的心肌內(nèi)，以便參與心肌的修復(fù)與再生是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點7。由于不同種屬來源的干細(xì)胞的分化能力有較大的差異8，因此，人的干細(xì)胞在運用于臨床之前，還需要將人的干細(xì)胞植入動物心肌內(nèi)，以觀察植入的人干細(xì)胞是否分化為人的心肌細(xì)胞9。同新鮮冰凍切片相比，石蠟切片可以保持良好的組織形態(tài)，但在石蠟切片中運用免疫熒光檢出抗原信號的靈敏性明顯減低。myosin是心肌肌纖

10、維的重要組成部分，Cx-43又稱為閏盤、縫隙連接蛋白。如果觀察到移植的人干細(xì)胞表達(dá)myosin與 Cx-43，那么就可以認(rèn)定移植的人干細(xì)胞向人心肌細(xì)胞分化，而且可以在心肌細(xì)胞的電興奮活動中與其他心肌細(xì)胞協(xié)同收縮6。本研究建立了一種人心肌石蠟切片熒光雙標(biāo)記的方法，我們相信這種方法將在研究人的干細(xì)胞移植和心肌的修復(fù)與再生方面發(fā)揮重要作用。 參考文獻(xiàn)1 Chen XJ，Xiao MD. Cell transplantation for heart repair. Guowai Yixue Section of Pathophysiol Clin Med，2003，23：47-49.陳緒軍，

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16、的動物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號標(biāo)記 的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。（2）我的做法是兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育?？贵w濃度、孵育時間要仔細(xì)摸索，我感覺一抗4度孵育過 夜比較好，背景比較清晰。（3）我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對照是PBS+熒光標(biāo)記 物。（4）封閉血清與二抗來源動物一致，我用的是10%的正常donkey血清。（5）其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。注意幾點：1）最好是不同種屬來源的一抗，而且最好都

17、是單抗。這樣就要選擇相應(yīng)不同種屬來源的二抗，避免同種屬來源的二抗與兩個一抗的交叉反應(yīng)。選擇單抗也是避免交叉反應(yīng)和假陽性。好的抗體真的還是很重要。2）如果條件所限，只找到一種抗體，而且說明書沒有明確說可以做免疫熒光怎么辦？這個可能不是說就一定不能做，也可能是廠家沒做這方面的實驗，可以大膽的try3)為何免疫雙標(biāo)一般是免疫熒光為主？一方面是不同抗體標(biāo)記不同的熒光，圖片漂亮；另一方面也是為了避免SP和ABC法中還要封閉內(nèi)源性過氧化物酶等可能會引起假陽性反應(yīng)。4）是否可以用不同熒光染料直接標(biāo)記的不同一抗來做？可以做，過程還可省一步。但是注意沒有二抗的放大效應(yīng)，結(jié)果可能有時很難出來。5）免疫雙標(biāo)熒光的圖

18、像如何整合？可以用掃描共聚焦，或者用園子的軟件整合。注意及時照相，熒光過段時間會淬滅。免疫雙標(biāo)中，最為關(guān)鍵的是一抗、二抗的選擇以及恰當(dāng)?shù)拇钆洌?. 免疫雙標(biāo)做得好的基本原則是：一抗種屬不同，二抗匹配對應(yīng)的一抗，二抗不同顏色標(biāo)記，二抗之間無交叉反應(yīng)2. 抗體的選擇 一般根據(jù)本實驗相關(guān)的一些關(guān)鍵詞（抗體名稱、編號、目標(biāo)動物種屬、實驗方法.）來檢索一些檔次較高的文獻(xiàn)，看看圖片較好的文獻(xiàn)中研究者們用的哪個公司的什么編號抗體，不見得知名公司的抗體就一定做得出來，實踐檢驗過了的才是金標(biāo)準(zhǔn)。3. 封閉液的選擇 封閉液作用就是盡量封閉掉能與二抗結(jié)合產(chǎn)生非特異性染色的抗原。所以，封閉液盡量選擇與二抗種屬同源的血清封閉液。比如，二抗是“驢抗羊FITC、驢抗兔CY3”，那么最佳封閉液就是驢血清封閉液。免疫雙標(biāo)一抗的選擇主要有兩種形式:第一：一抗種屬來源相同：即一抗A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠；對于這種情況，采用的雙標(biāo)方法是順序法，即