環(huán)氧化物水解酶固定化研究現(xiàn)狀概要

1、環(huán)氧化物水解酶固定化研究環(huán)氧化物水解酶固定化研究現(xiàn)狀現(xiàn)狀目錄目錄. 環(huán)氧化物水解酶/來源.固定化EH(酶/細(xì)胞)現(xiàn)狀.小結(jié)及展望.環(huán)氧化物水解酶環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase, EH, EC.3.3.2.3)是一種醚水解酶，屬于/水解酶家族。該酶可用于催化外消旋環(huán)氧化物的對映選擇性水解，獲得高附加值的手性合成中間體光學(xué)純的環(huán)氧化物或者鄰位二醇。例：OCl+環(huán) 氧 化 物 水 解 酶OClHOClOH.環(huán)氧化物水解酶來源細(xì)菌細(xì)菌Agrobacterium radiobacter放射形土壤桿菌Steinreiber, A. et al., 2001De Vries et al.

2、, 2003Archelas, A. et al., 2001Orru, R. V. et al., 2001Faber, K. et al., 1999Rhodococcus sp.紅球菌Corynebacteriuim sp.棒狀桿菌屬M(fèi)ycobacterium paranicasm分枝桿菌Nocardia sp.諾卡氏菌Pseudomonas NRRLB-2994假單胞菌真菌真菌Aspergillus niger黑曲霉Weijers, C. A. et al., 1999Kim, H. S. et al., 2006Yeates, C. A. et al., 2006Helminthos

3、porum sativum小麥長蠕孢菌Diploida gossypinaBeauveria sulfurescens白僵菌酵母菌酵母菌Rhodotorulla glutinis 粘紅酵母Kotik, M. et al., 2005魚類魚類Mugil cephalusSung Hee Choi. et al., 2010綠豆綠豆Phaseolus radiatus L.Xu, W. et al., 2006.固定化EH（酶/細(xì)胞）現(xiàn)狀2.1 吸附法Kroutil等在研究來源于卡諾氏菌環(huán)氧化物水解酶固定化過程中，通過對比不同載體固定化酶活力回收發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化物水解酶吸附于DEAE-cellulos

4、e（二乙氨基乙基纖維素）上活力提高2倍以上。在固定化過程中混入非離子去垢劑（Triton X-100）可顯著提高其熱穩(wěn)定性。(Kroutil et al., 1998)2.1 吸附法DEAE-cellulose載體載體酶酶/菌菌酶活酶活保留保留熱穩(wěn)熱穩(wěn)定性定性重復(fù)重復(fù)批次批次底物底物EFromDEAE-cellulose酶90%42-(對-硝基苯基)環(huán)氧乙烷減小Karboune et al., 2010225%提高5（55%）1,2-環(huán)氧丁烷微降Kroutil et al., 199870%下降7（81%）2-(對-硝基苯基)環(huán)氧乙烷減小Karboune et al., 200570%微降10

5、（72.4%）縮水甘油苯基醚賈濤等，200865%不變Karboune et al., 2001文獻(xiàn)閱讀過程中發(fā)現(xiàn)，利用吸附法固定化環(huán)氧化物水解酶研究中大部分都采用了DEAE-cellulose為載體，故列表對比固定化后各參數(shù)值。2.2 共價法Eupergit C/Eupergit C 250LYildirim等將環(huán)氧化物水解酶共價交聯(lián)于環(huán)氧樹脂Eupergit C 250L上（圖1），使得其對環(huán)氧苯乙烯對映體選擇性提高2.5倍左右、對環(huán)氧丙醇、環(huán)氧氯丙烷E均有提高，熱穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性亦顯著提高（圖2），操作穩(wěn)定性表現(xiàn)為10個批次（活力保留95%、(S)-氧化苯乙烯ee99% ）。 (Yil

6、dirim et al., 2011；Yildirim et al., 2013 )圖1圖22.2 共價法Eupergit C/Eupergit C 250LMateo等通過將環(huán)氧樹脂Eupergit C進(jìn)行改性（圖），固定化過程即利用乙二胺或亞氨基二乙酸親和攻擊環(huán)氧樹脂，接著中性PH下酶與載體共價結(jié)合，然后堿性條件下酶分子親和官能團(tuán)（氨基、巰基、羥基）與載體上其他環(huán)氧基團(tuán)共價結(jié)合，最后添加小分子量的親和試劑滅活未反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)。 (Mateo et al., 2003)2.2 共價法Eupergit C/Eupergit C 250L通過EDA（乙二胺）改性環(huán)氧樹脂方法固定化環(huán)氧化物水解酶酶

7、活保留均達(dá)到95%以上，熱穩(wěn)定性較游離酶有大幅提高，重復(fù)利用12批次(S)-氧化苯乙烯ee99%，酶活未見明顯損失。固游122.2 吸附共價法改性環(huán)氧硅膠Petri等將硅膠改性表面附帶環(huán)氧基團(tuán)后與來源于黑曲霉的環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行吸附共價連接，酶活保留達(dá)90%，最適T和PH均未變化，拆分2-(對-硝基苯基)環(huán)氧乙烷批次可達(dá)9次而酶活無顯著降低。研究該固定化酶對助溶劑二甲基亞砜（DMSO）穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，相比于游離酶，固定化酶在含有20%助溶劑（DMSO）緩沖液中兩周后酶活保留達(dá)70%以上（圖）。( Petri et al., 2005)DMSO2.3 交聯(lián)法磁性納米SiO2顆粒Kim等利用具有船瓶結(jié)

8、構(gòu)的介孔SiO2裝配磁性納米顆粒后將來源于魚類的環(huán)氧化物水解酶共價交聯(lián)與此納米酶反應(yīng)器，該法載體的船瓶結(jié)構(gòu)可有效避免固定化酶的滲漏，磁性顆粒使得固定化酶易重復(fù)，熱穩(wěn)定性較游離酶提高10倍以上，拆分氧化苯乙烯重復(fù)7個批次（活力保留50%）(S)-氧化苯乙烯ee98% 。(Kim et al., 2013b)Kim等首先利納米磁性SiO2及聚苯胺納米纖維對環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行共沉淀，再加入用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，固定化酶拆分氧化苯乙烯，批次試驗(yàn)可達(dá)7次（活力殘余40-50%）且ee均大于98%。(Kim et al., 2013a)聚苯胺納米纖維納米磁性SiO2Kim等首先利用納米磁性SiO2及聚苯胺納米

9、纖維對環(huán)氧化物水解酶進(jìn)行共沉淀，再加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，固定化酶拆分氧化苯乙烯，批次試驗(yàn)可達(dá)7次（活力殘余40-50%）且ee均大于98%。 (Kim et al., 2013a)2.3 交聯(lián)法磁性納米SiO2顆粒2.4 一鍋固定化法Ni-NTA -Fe3O4、NiO/Co()-SiO2Wang等將氧化鐵納米顆粒與油酸共沉淀后與甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚形成表面附著環(huán)氧基團(tuán)的核殼結(jié)構(gòu)，然后在依次與乙二胺、戊二醛、NTA（氮川三乙酸）衍生物形成席夫堿，最后Ni粒子螯合到NTA臂內(nèi)，進(jìn)而可以從粗酶液中一步選擇性提取固定化帶有His-tag重組酶。(Wang et al., 2011)2.4 一鍋固定化

10、法Ni-NTA -Fe3O4、NiO/Co()-SiO2Wang等利用該法固定化環(huán)氧化物水解酶拆分2-(對-硝基苯基)環(huán)氧乙烷得到ee99% (R)-2-(對-硝基苯基)環(huán)氧乙烷，批次重復(fù)8次以上，酶活保留80%以上。(Wang et al., 2011)Choi 等利用類似的方法（磁性SiO2裝配NiO）一步固定化魚類環(huán)氧化物水解酶拆分氧化苯乙烯得到ee98%(S)-氧化苯乙烯，批次可重復(fù)10次以上（酶活保留90%）。(Choi et al., 2010)Cassimjee等將Wang等方法中用Co()替代Ni-NTA亦成功實(shí)現(xiàn)對環(huán)氧化物水解酶的一鍋法固定化。(Cassimjee et al

11、., 2011)2.5 包埋法Maritz等將來源于紅冬孢酵母的環(huán)氧化物水解酶細(xì)胞包埋于海藻酸鈣內(nèi)，活力保留50%，拆分1,2-環(huán)氧辛烷可重復(fù)操作8個批次（剩余酶活80%）。(Rhodosporidium et al., 2003)鄒等將來源于黑曲霉的環(huán)氧化物水解酶重組于大腸桿菌內(nèi)菌體包埋于海藻酸鈣內(nèi)，酶活保留最高可達(dá)82.4%，拆分外消旋的環(huán)氧氯丙烷7個批次后酶活殘余43%。(鄒樹平等，2013)2.6 分子印跡法在有機(jī)溶劑（印記溶劑）中，模板分子在交聯(lián)劑作用下與可聚合功能性單體（如甲基丙烯酸，4-乙烯基吡啶）聚合，當(dāng)模板分子被取出后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)

12、的空穴，這樣的空穴將對模板分子及其類似物（大小、形狀、化學(xué)功能等）具有選擇識別特性。(Gary J. Lye, 1999)空穴2.5 分子印跡法Kronenburg等將來源于酵母菌的環(huán)氧化物水解酶首先在衣康酸酐作用下進(jìn)行衍生化，接著在無水環(huán)己烷與乙二醇二甲基丙烯酸酯進(jìn)行共聚合形成生物塑料，在共聚之前，蛋白酶分子在水相中經(jīng)模板分子（底物）進(jìn)行分子印跡。該報道是首次將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于隸屬于/水解酶家族的環(huán)氧化物水解酶。(Kronenburg et al., 2001)衣康酸酐2.6 分子印跡法研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同構(gòu)型底物（S型、R型）印記后酶對1,2-環(huán)氧辛烷的對映體選擇性（E）發(fā)生明顯變化，甚至顛

13、倒。對不同構(gòu)型1,2-環(huán)氧辛烷相對活力變化顯著。R型S型2.6 分子印跡法將環(huán)氧化物水解酶與共聚體吸附固定化后發(fā)現(xiàn)，相較于游離酶半衰期最高提高15倍，且經(jīng)強(qiáng)酸（HCl）洗脫后仍可保留50%酶活，游離酶在此情況下瞬間失活。.小結(jié)及展望1.現(xiàn)階段固定化環(huán)氧化物水解酶距離工業(yè)化固定化酶（如卡拉膠包埋腈水解酶重復(fù)批次達(dá)200批）尚有很大差距；2.對比發(fā)現(xiàn)EH固定化研究集中在環(huán)氧樹脂Eupergit 、DEAE-cellulose及磁性納米SiO2顆粒三種載體；3.現(xiàn)階段文獻(xiàn)研究多為環(huán)氧化物水解酶固定化酶，固定化細(xì)胞報道不多；4.未見有固定化酶后進(jìn)行填充床生物反應(yīng)器連續(xù)操作拆分制備手性環(huán)氧化物的報道；5

14、.尋找篩選成功工業(yè)化應(yīng)用固定化酶/細(xì)胞方法值得借鑒.REFERENCESCassimjee, K.E., Kourist, R., Lindberg, D., Wittrup Larsen, M., Thanh, N.H., Widersten, M., Bornscheuer, U.T., Berglund, P., 2011. One-step enzyme extraction and immobilization for biocatalysis applications. Biotechnol J 6, 463-469.Choi, S.H., Kim, H.S., Lee, I.S.

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