兩株腫瘤細胞系HLAI類分子基因表達水平的鑒定及意義

1、兩株腫瘤細胞系HLA?I類分子基因表達水平的鑒定及意義       作者：關德瑩，沈晗，邵紅偉，黃樹林  【摘要】  目的 探討兩株常見腫瘤細胞系Hela細胞和BEL?7402細胞HLA?I類分子基因表達水平及其影響CTL反應性的可能意義。方法 提取腫瘤細胞的基因組DNA，利用PCR反應在基因組水平鑒定HLA?I類分子基因的拷貝數(shù)情況；提取細胞總RNA， RT?PCR反應合成cDNA，利用PCR反應鑒定腫瘤細胞HLA?I類分子在RNA水平的表達情況。結果兩株腫瘤細胞的HLA?I類基因在基因組水平的拷貝數(shù)無明顯下降；

2、在RNA水平上，Hela細胞的HLA?A、HLA?B和HLA?C基因均有表達，表達水平無明顯下降，BEL?7402細胞的HLA?A和HLA?C基因有表達，但HLA?C基因表達水平降低，而HLA?B基因未見明顯表達。 結論 RNA水平上，部分HLA?I類分子基因表達的降低或缺失推測可能是導致BEL?7402細胞比Hela細胞出現(xiàn)CTL反應性下降的原因之一。 【關鍵詞】  HLA?I類分子；Hela細胞；BEL?7402細胞；mRNA Abstract:Objective To investigate the expression level of HLA?I molecule gene

3、s in two tumor cell lines, Hela and BEL?7402 and the possible significance of CTL reactions.Methods Genome DNA were extracted from these two tumor lines for detecting the HLA?I molecule genes levels by PCR.Total RNA from two cell lines were extracted for RT?PCR, HLA?I molecule genesexpression on RNA

4、 level were judged by PCR and agarose gel electrophoresis.Results  HLA?I molecule genes levels did not decrease significantly on genome level.On RNA level, HLA?A, HLA?B and HLA?C all expressed normally without significant descent in Hela cell line.The expression of HLA?A and HLA?C were both det

5、ected in BEL?7402 cell line, but the expression of HLA?C gene showed significant decease, and no expression of HLA?B gene were detected on RNA level.Conclusion  At RNA level, reduction or absence HLA?I molecule genes expression of Hela cell line were not found, however, the partial descent and

6、absence of HLA?I molecule genes expression in BEL?7402 cell line was the possible reason for the reduction of CTL reaction. Key words:HLA?I molecule；Hela cell line ；BEL?7402 cell line；mRNA 人類主要組織相容性復合物（MHC），又稱為人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA )系統(tǒng)，位于第6號染色體短臂（6p21.31）約3.6Mb1，按功能差別可大致分為HLA?I類分子和HLA?

7、II類分子兩大類，其中HLA?I 類分子在機體的細胞免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤免疫的核心是機體針對腫瘤的細胞免疫反應，其中CD8+CTL細胞必需依靠腫瘤自身HLA?I類分子呈遞的腫瘤抗原才能得以活化發(fā)揮殺傷作用。但由于腫瘤細胞的遺傳不穩(wěn)定性，會導致HLA?I類分子的表達下降或缺失，是引起腫瘤免疫耐受形成的重要原因2, 3。因此，了解腫瘤細胞的HLA?I類分子表達情況對研究如何打破免疫耐受，開展過繼性細胞學治療十分必要。在前期通過CTL殺傷實驗的研究中發(fā)現(xiàn)，CTL對本室保藏的人宮頸癌細胞Hela的殺傷活性要高于人肝癌細胞株BEL?7402(結果未發(fā)表)，為探討此現(xiàn)象的發(fā)生是不是涉及到了

8、腫瘤細胞HLA?I類分子基因的表達變化，本文在基因組水平及RNA水平對兩株腫瘤細胞的HLA?I類分子基因的表達情況進行了鑒定分析，現(xiàn)報道如下。    1  材料與方法 11  細胞     Hela細胞、BEL?7402細胞均為廣東藥學院生物制藥研究所保藏，健康人外周血由廣州市血液中心提供，用人淋巴細胞分離液分離出單個核細胞。 12  主要試劑與儀器    RPM1640培養(yǎng)基、胎牛血清購置Gibico公司；T4連接酶、M?MLV反轉錄酶、Taq酶、dNTP、RNa

9、seInhibitor、Oligod T均購自Fermentas公司；Trizol 0020購自Invitrogen公司；DEPC購自Sigma公司；DNA Marker DL 2000、100購自Biotech公司，基因組DNA提取試劑盒購自Pearl公司；PCR儀（Whatman Biometra，T?Gradient Thermoblock型）；電泳儀（Bio?RAD，Power Pac 300型）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 4100型）。 13  細胞基因組DNA的提取         收集傳代培

10、養(yǎng)24 h的Hela細胞和BEL?7402細胞，細胞數(shù)約為2×106，按照基因組DNA提取試劑盒的使用說明進行操作，將提取獲得的DNA進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按相同方法，提取健康人外周血單個核細胞（PBMC）的基因組DNA作為對照。 14  PCR反應鑒定基因組水平HLA?I基因的拷貝數(shù)情況     根據(jù)GenBank中已公布的人HLA?I類基因HLA?A、HLA?B和HLA?C核酸序列，共設計3對通用PCR反應引物，并設計1對針對GAPDH基因組序列的內參引物，委托廣州英駿公司合成，4對引物序列具體為：  

11、;  PGA1:5?cctctgyggggagaagcaa?3，PGA2:5?gac tcagaagtgctggactc?3；    PGB1:5?gggaggagcgaggggaccscag?3，PGB2:5?ggaggccatccccggcgacctat?3；    PGC1:5?agcgaggkgcccgcccggcga?3，PGC2:5?ggagatggggaaggctccccact?3；    PGG1:5?aaggtcggagtcaacgg?3，PGG2:5?atc tcgggcgg

12、gaatag?3    用50 L反應體系進行擴增，其參數(shù)為：95 預變性3 min后，按95 25 s、60 30 s、72 80 s進行8個循環(huán)反應，然后按照95 20 s、55 30 s、72 90 s進行30個循環(huán)反應，最后延伸7 min。PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。 15  RT?PCR反應鑒定RNA水平HLA?I基因的表達情況     分別收集3×106Hela細胞、 BEL?7402細胞及健康人外周血單個核細胞，按 Trizol Reagent使用說明進行抽提細胞總RNA，

13、以RNA為模板進行逆轉錄PCR反應，反應體系中加入10 mmol/L的dNTPs 2 L、RNaseInhibitor 20 U、OligodT 0.3 g、RNA模板6 L、5×Buffer 8 L、M?MLV逆轉錄酶200 U，加無菌去離子水至終體積40 L?；靹蚝?2 反應60 min，最后90 5 min滅活M?MLV活性，4 保存合成的cDNA。    擴增HLA?A、B、C 3個基因及內參GAPDH基因的引物均由Invitrogen公司合成。具體序列如下：    PRA1:5?gacgacacgcagt

14、tcgtgc?3,PRA2：5?ttg gaccgcggcggacatg?3；    PRB1：5?accagagcgaggccgggt?3，PRB2：5?ctg gaccgccgcggacac?3；    PRC1：5?cgccgcgagtccgagagg?3，PRC2：5?ctg gaccgccgcggacac?3；    PRG1：5?aggtcggagtcaacggatttg?3，PRG2:5?gtg atggcatggactgtggt?3    用50 L反應體系進

15、行擴增，其參數(shù)為：94 預變性3 min，按94 60 s，55 40 s，72 60 s進行35個循環(huán)反應。 2  結果 21  基因組DNA的提取鑒定     0.8%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示試劑盒法提取的Hela細胞、BEL?7402細胞及健康人PBMC基因組DNA條帶明亮，無明顯托尾，能滿足作為PCR反應擴增模板的需要，見圖1。    M.DNA marker; A.PBMC of healthy people; B.Hela cell; C.BEL?7402 cell 圖1  基因組D

16、NA凝膠電泳（略） Fig.1  Gel electrophoresis analysis of genome DNA 22  HLA?I類基因在基因組水平拷貝數(shù)情況的鑒定     利用特異性PCR引物進行PCR反應檢測基因組水平HLA?I類基因的拷貝數(shù)情況，結果見圖2，Hela細胞和BEL?7402細胞的HLA?I類基因（HLA?A、B、C）在基因組水平的表達與健康人PBMC無明顯差別。 23  細胞總RNA提取鑒定    從Hela細胞和BEL?7402細胞中，提取出總RNA， 1%瓊脂糖電

17、泳鑒定 。結果顯示提取的總RNA有3條帶，從上至下分別為28 s，18 s，5 s，其中18 s和28 s這2條帶的RNA亮度明顯高于5 s帶，證明RNA降解較少，所提取RNA質量較高，能滿足下一步RT?PCR反應的需要，見圖3。    M.DNA marker; 1.HLA?A gene of healthy people; 2.HLA?A gene of Hela; 3.HLA?A gene of BEL?7402; 4.HLA?B gene of healthy people; 5.HLA?B gene of Hela; 6.HLA?B gene of BE

18、L?7402; 7.HLA?C gene of healthy people; 8.HLA?C gene of Hela; 9.HLA?C gene of BEL?7402; 10.GAPDH gene of healthy people; 11.GAPDH gene of Hela; 12.GAPDH gene of BEL?7402. 圖2  基因組水平HLA?I基因PCR結果（略） Fig.2  PCR Results of HLA?I gene at genome level A.Hela cell     B.BEL?740

19、2 cell  圖3  腫瘤細胞RNA凝膠電泳圖（略） Fig.3  Gel  electrophoresis of the RNA of tumor cells 24   HLA?I類基因在RNA水平上的表達情況 241  Hela細胞HLA?I類基因的表達  以Hela細胞cDNA為模板，進行HLA?I類基因的PCR擴增，2%的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示Hela細胞HLA?A、HLA?B和HLA?C 3基因都擴增出比較明亮的DNA條帶，對照組健康人PBMC無明顯差異，見圖4中2,5,8,11泳道。 242 

20、; BEL?7402細胞HLA?I類基因的表達  利用2%的瓊脂糖凝膠電泳對BEL?7402細胞HLA?I類基因擴增情況進行鑒定，結果顯示HLA?A基因的擴增條帶較明亮與對照組無明顯差別，HLA?C基因的擴增條帶亮度較對照組有明顯的降低，而HLA?B基因未見DNA條帶擴增出來，見圖4中3，6，9，12泳道。 3  討論     人類主要組織相容性復合物（MHC），又稱為人類白細胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA )系統(tǒng)是一個很大的基因家族，在脊椎動物適應性免疫應答中起關鍵作用。在機體的腫瘤免疫應答過程中，

21、HLA?I類分子限制的CD8+細胞毒性T淋巴細胞 (CTL)發(fā)揮著重要作用，腫瘤免疫應答刺激信號的產生主要涉及到MHC?抗原肽?TCR三原體結構的生成4。    M.DNA marker; 1.HLA?A gene of healthy people; 2.HLA?A gene of Hela; 3.HLA?A gene of BEL?7402; 4.HLA?B gene of healthy people; 5.HLA?B gene of Hela; 6.HLA?B gene of BEL?7402; 7.HLA?C gene of healthy people

22、; 8.HLA?C gene of Hela; 9.HLA?C gene of BEL?7402; 10.GAPDH gene of healthy people; 11.GAPDH gene of Hela; 12.GAPDH gene of BEL?7402. 圖4  RNA水平HLA?I基因PCR結果（略） Fig.4  PCR Results of HLA?I gene at RNA levelHLA?I類分子的表達異常是發(fā)生腫瘤免疫逃逸，形成免疫耐受的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤細胞中都存在著HLA基因丟失或表達下調的現(xiàn)象。有研究利用免疫組化檢測證實，2575的惡性腫瘤細胞有不同形式的HLAI類分子表型改變，從 HLA?I類分子陽性上皮細胞衍生的腫瘤細胞中，3988存在 HLAI類分子的表達下降或丟失，而正常細胞均表現(xiàn)為 HLA?I類分子陽性。以上數(shù)據(jù)證明腫瘤細胞的HLA?I類分子的表達降低或缺失是惡性腫瘤的一個較為普遍的病理性改變，是腫瘤區(qū)別正常組織的一項重要指標5。     在前期