心臟缺血再灌注損傷后一氧化氮合酶的變化(一)

1、心臟缺血再灌注損傷后一氧化氮合酶的變化(一)    作者：唐省三,馬亞珍,劉紅云,朱曉琴,雷水生【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷Changes of nitric oxide synthesis in cardiac ischemia reperfusion injury【Abstract】 AIM: To investigate the expression and function of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inducible NOS (iNOS) during ischemiareperf

2、usion injury (IRI) in rat hearts. METHODS: IRI was induced by clamping the left anterior descending (LAD) of coronary artery for 1h, followed by reperfusion. Nitric oxide synthase (NOS) activities of hearts was assayed at various time points and NOS protein levels as well as NOS mRNA expression were

3、 determined by Western blot and RTPCR methods respectively. RESULTS: eNOS activity, protein level and mRNA expression all increased after 26 h of IRI and decreased after 3 d of IRI and then gradually returned to basal level after 21 d. iNOS was expressed after 12 h of IRI and reached the peak level

4、at day 3 after IRI and then decreased to basal level. CONCLUSION: The expression of iNOS is high while that of eNOS is low during cardiac ischemiareperfusion injury. Proper regulation of eNOS and iNOS expression may be therapeutically helpful in treating patients with cardiac ischemiareperfusion inj

5、ury.【Keywords】reperfusion injury; nitric oxide synthase; heart【摘要】 目的： 研究大鼠心臟缺血再灌注損傷(IRI)過(guò)程中一氧化氮合酶(NOS) 的變化規(guī)律及其作用. 方法： 制作SD大鼠心臟IRI動(dòng)物模型,用同位素法測(cè)定正常及IRI心組織的NOS活性；用Western印跡和逆轉(zhuǎn)錄PCR法分析eNOS和iNOS 在IRI過(guò)程中蛋白和基因表達(dá)的變化.結(jié)果： 心臟eNOS活性、蛋白和mRNA表達(dá)水平，在缺血再灌注26 h后均增高，3天后降低，21天后逐漸恢復(fù)到正常水平. 心臟iNOS活性、蛋白和mRNA表達(dá)水平，在缺血再灌注12 h后開

6、始表達(dá)，3天達(dá)高峰，然后逐漸降至正常水平. 結(jié)論： 單純?nèi)毖⒉灰餘OS 活性的明顯變化,再灌注損傷使NOS的mRNA表達(dá)增加,酶的合成增多,活性增高.【關(guān)鍵詞】再灌注損傷；一氧化氮合酶；心臟0引言一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起著極其重要的作用1.一氧化氮合酶(nitric oxide synthesis, NOS) 可分為原生型(cNOS) 和誘生型(iNOS) .cNOS 依存在的部位分為神經(jīng)型(nNOS) 和內(nèi)皮型(eNOS).心臟組織內(nèi)的NOS同功酶有兩種,即eNOS和iNOS. 參與炎性反應(yīng)及急性排斥反應(yīng)等病理過(guò)程2. 我們研究eNOS和iNOS在心臟

7、IRI中的變化規(guī)律及其作用,為其防治提供理論基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料SD大鼠購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；iNOS Assay Kit 購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOS mAb 購(gòu)自武漢博士德公司； HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗購(gòu)自Sigma 公司； Trizol裂解液、Oligo(dT) 、TaqDNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RT)均為美國(guó)Gibco 公司產(chǎn)品；eNOS和iNOS 引物及內(nèi)參照由上海博亞生物技術(shù)公司合成. 冠狀動(dòng)脈阻斷再灌注模型制備3后在不同的再灌注時(shí)間點(diǎn)處死大鼠,收集心臟標(biāo)本,液氮急凍, -70保存?zhèn)溆?1.2方法取雄性200220

8、 g SD大鼠120只,隨機(jī)分為缺血再灌注（IRI）組和假手術(shù)（對(duì)照,Control）組，每組60只，在再灌注不同時(shí)間點(diǎn)（0, 0.5, 1, 2, 6, 12 h和1, 3, 7, 14, 21, 30 d ）處死大鼠，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只.1.2.1NOS活性的測(cè)定IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2 g,對(duì)照組大鼠取左室相應(yīng)區(qū)心肌0.2 g,采用iNOS Assay Kit進(jìn)行測(cè)定. 心組織NOS活性的測(cè)定采用3H精氨酸同位素法4 , 心組織在4含有1 mmol/L leupeptin, 2 mmol/L aprotonin, 1 mmol/Lphenylemthylsulfonyl fl

9、uoride, 1 mmol/L DTT, 1 ml/L Triton X100的30 mmol/L HEPES緩沖液中勻漿,反應(yīng)液為30 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.4),含1 mmol/L CaCl2, 100 mmol/L NADPH, 300 mmol/L tetrahydrobiopterin, 1 mmol/L dithiothreitol,以40 mmol/L L3H精氨酸(37 kBq/反應(yīng)液)為反應(yīng)底物,在37下反應(yīng)30 min,用200 L 含100 mmol/L EGTA的終止液終止反應(yīng),反應(yīng)體系過(guò)5 cm的Dowex離子交換層析柱,加閃爍液后讀取放射性記數(shù)

10、. 蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.1.2.2Western印記檢測(cè)iNOS和eNOS蛋白表達(dá)IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2 g,對(duì)照組大鼠取左室相應(yīng)區(qū)心肌0.2 g,以51(V/m)比例置勻漿緩沖液（含50 mmol/L Tris pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 5 g/L cholate sodium, 1 g/L SDS, 2 mmol/L EDTA, 10 g/L Triton X100,100 mL/L甘油，1 mmol/L PMSF, 2 mg/L aprotinin）勻漿破碎組織. 勻漿液于4 10 000

11、 g離心15 min，收集上清液并用dyebinding (BioRad)方法以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白濃度. 取含30 mg總蛋白的各組標(biāo)本勻漿上清液點(diǎn)樣進(jìn)行75 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離Mr 135 000的iNOS及150 000的eNOS蛋白. Mr標(biāo)準(zhǔn)采用預(yù)染的彩虹重組蛋白(Amersham International plc, Buckinghamshire, England). 電泳后的凝膠通過(guò)Western印記裝置（BioRad）電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至hybond C膜(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Englan

12、d).轉(zhuǎn)移膜經(jīng)封閉、與1500稀釋的iNOS或eNOS mAb 4孵育過(guò)夜、洗滌、與15000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG室溫孵育1 h和第2次洗滌，最后用ECL Western印記熒光檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL) 顯色、曝光于X光底片(Fuji, Tokyo, Japan)和顯影、定影.將感光X 光片上蛋白條帶應(yīng)用HPIAS 2000 型圖像分析系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像工程公司生產(chǎn)) 掃描測(cè)定光密度(OD) 定量.1.2.3RT PCR檢測(cè)iNOS和eNOS的轉(zhuǎn)錄IRI組大鼠取左室缺血區(qū)心肌0.2 g,對(duì)照組大鼠取左室相應(yīng)

13、區(qū)心肌0.2 g,采用Trizol試劑提取總RNA，以thermoscriptTM RTPCR系統(tǒng)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng). PCR反應(yīng)采取等量逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板，分別以iNOS, eNOS, actin特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng). 擴(kuò)增iNOS的引物對(duì)為： sense： 5TGGCTTGCCCTTGGAAGTTTCTC3, antisense: 5TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA3，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物為574 bp iNOS cDNA片段，PCR反應(yīng)條件為95 5 min；95 30 s，60 45 s，72 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 10 min. 擴(kuò)增eNOS的引物對(duì)為： se

14、nse: 5TACGGAGCAGCAAATCCAC3, antisense: 5CAGGCTGCAGTCCTTTGATC3，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物812 bp，PCR反應(yīng)條件為95 5 min；95 45 s，60 45 s，72 1.25 min，共30個(gè)循環(huán)；72 10 min. 內(nèi)對(duì)照actin的擴(kuò)增引物對(duì)為： sense: 5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3, antisense: 5CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3，預(yù)計(jì)產(chǎn)物為540 bp， PCR反應(yīng)條件為95 2 min； 95 30 s， 60 45 s， 72 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 10 min.

15、PCR產(chǎn)物以含0.5 mg/L溴乙錠的10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外光照下觀察電泳條帶,用BioRad凝膠分析系統(tǒng)分析結(jié)果，結(jié)果以光密度值（OD）表示.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)均以x±s表示. 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析, P0.05為有顯著性差異.2結(jié)果2.1心臟IRI時(shí)NOS活性的變化單純?nèi)毖? h，心臟NOS活性與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化.心臟恢復(fù)血供再灌注0.5 h后cNOS活性即開始升高, 以26 h最高, 與對(duì)照組相比,差異有顯著性意義(P0.01) ；但12 h后卻迅速下降,3 d時(shí)活性最低與對(duì)照組相比,差異有顯著性意義(P0.01),以后逐日恢復(fù),21 d時(shí)心恢復(fù)

16、正常. iNOS活性在對(duì)照組心臟表達(dá)微弱,再灌注2 h 后逐漸升高, 12 h3 d活性達(dá)高峰, 與對(duì)照組相比差異有顯著性意義(P0.01),以后逐漸下降,7 d 后基本恢復(fù)正常(Tab 1) .表1心臟IRI后cNOS和iNOS的活性變化（略）2.2Western印跡IRI組再灌注0.5 h后心臟eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)即開始升高,2 h達(dá)到高峰,12 h后開始減少,3 d時(shí)為最低,以后逐漸恢復(fù),21 d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平,與NOS活性變化相一致.對(duì)照組心臟檢測(cè)出iNOS蛋白微量表達(dá),但表達(dá)量遠(yuǎn)低于eNOS, IRI可誘導(dǎo)其表達(dá),在12 h后表達(dá)逐漸增強(qiáng),3 d時(shí)表達(dá)最強(qiáng),隨后逐漸減弱,21 d時(shí)

17、恢復(fù)對(duì)照組水平,也與iNOS的活性變化相一致(Fig 1, Tab 2).表2Western印跡法測(cè)定心臟IRI 后eNOS 和iNOS 蛋白表達(dá)(略)2.3NOS mRNA的基因表達(dá)IRI組心臟再灌注早期(0.512 h) 即可誘導(dǎo)eNOS mRNA表達(dá)增強(qiáng),2 h達(dá)高峰,此后隨著損傷程度加重,其表達(dá)迅速下降. 3 d低于對(duì)照組,以后逐步恢復(fù),21 d已相當(dāng)對(duì)照組水平. 在對(duì)照組心臟iNOS mRNA表達(dá)微弱,再灌注12 h后開始增強(qiáng),3 d達(dá)高峰,21 d恢復(fù)正常水平(Fig 2, Tab 3) .以上eNOS和iNOS mRNA的消長(zhǎng)變化與蛋白質(zhì)的表達(dá)和酶活力的變化一致.表3大鼠心臟IR

18、I后eNOS和iNOS mRNA半定量結(jié)果(略)3討論eNOS來(lái)源的NO具有舒張心血管,抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)和血小板的凝聚作用5，從而對(duì)心臟可能起到保護(hù)作用. Song等6的研究表明,在早期eNOS的過(guò)量表達(dá)對(duì)小鼠骨骼肌的IRI具有保護(hù)作用,隨著損傷過(guò)程的進(jìn)展, 心臟結(jié)構(gòu)和功能的損害不斷加重,eNOS表達(dá)也相應(yīng)迅速下降.這可能由于大量心肌細(xì)胞壞死和凋亡,導(dǎo)致eNOS的合成減少有關(guān). eNOS的表達(dá)隨著心臟損傷修復(fù)和心功能的恢復(fù)逐步恢復(fù). NO在心肌再灌注損傷中加重心肌損害. 缺血再灌注情況下,多種細(xì)胞因子上調(diào)巨噬細(xì)胞等內(nèi)的iNOS的mRNA表達(dá),立即產(chǎn)生大量的iNOS和NO. 過(guò)量的NO與氧迅速反應(yīng)

19、生成大量的氧自由基如過(guò)氧亞硝酸陰離子(ONOO),后者可進(jìn)一步反應(yīng)生成HO-, NO2, NO3-等,其結(jié)果是引起和加重心肌缺血再灌注損傷7.我們發(fā)現(xiàn)，單純?nèi)毖? h對(duì)心臟NOS活性無(wú)明顯影響,再灌注30 min 后NOS活性即開始升高,26 h到達(dá)高峰,持續(xù)到6 h，此后迅速下降,24 h降低到正常以下,21 d時(shí)恢復(fù)至正常水平. RTPCR分析發(fā)現(xiàn)eNOS及iNOS mRNA的變化與其蛋白變化相一致. 可見在IRI中,早期eNOS的高表達(dá)可能參與了早期心血流的調(diào)節(jié),對(duì)抑制心血管痙攣、減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)；iNOS參與介導(dǎo)了心臟IRI的炎癥損傷.可以設(shè)想,在器官保存過(guò)程中或移植后早期使用i

20、NOS 的抑制劑,將會(huì)減少急性心肌壞死和凋亡以及急性排斥反應(yīng)的發(fā)生, 對(duì)IRI 起到保護(hù)作用,促進(jìn)心功能的恢復(fù)，為臨床提供科學(xué)的理論依據(jù).【參考文獻(xiàn)】1 張榮慶，徐凱，程何祥，等. 卡維地洛對(duì)缺氧心肌細(xì)胞NO生成的影響J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002；23（22）：2071-2073.Zhang RQ, Xu K, Cheng HX, et al. Effects of carvedilol on nitric oxide production by myocardial cells during anoxia J. J Fourth Mil Med Univ, 2002；23（22）：207

21、1-2073.2 許春梅，董衛(wèi)國(guó)，余保平，等. 低氧誘導(dǎo)因子1及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在炎癥性腸病中的表達(dá)J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004；25（17）：1558-1561.Xu CM, Dong WG, Yu BP, et al. Expression of hypoxiainducible factor 1 alpha(HIF1) and inducible nitric oxide synthase(iNOS) genes in inflammatory bowel disease J. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（17）：1558-1561.3 Suzuki M, Sasaki N, Miki T, et al. Role of sarcolemmal K(ATP) channels in cardioprotection against ischemia/reperfusion injury in mice J. J Cl