山藥可能可以幫助受化療老鼠骨髓細(xì)胞數(shù)目的恢復(fù)

1、山藥可能可以幫助受化療老鼠骨髓細(xì)胞數(shù)目的恢復(fù)蘇佩芬, 李青晉, 徐智鍵, Spencer Benson, U. K. Singha, 王昇陽, 徐麗芬, 楊寧蓀中央研究院生物農(nóng)業(yè)研究所籌備處摘要細(xì)胞激素是很重要的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)物，特別的細(xì)胞激素已經(jīng)應(yīng)用在臨床測試癌癥或其他疾病的免疫治療上。然而高濃度的細(xì)胞激素往往會(huì)引起細(xì)胞毒性而降低其實(shí)用性。山藥是一種傳統(tǒng)的中藥並且已經(jīng)廣泛應(yīng)用，並且民間相信它具有免疫調(diào)節(jié)的活性。我們將山藥中萃取之分餾層與interleukin-2 (IL-2)結(jié)合並利用離體(ex-vivo)實(shí)驗(yàn)評(píng)估山藥對(duì)免疫細(xì)胞之影響或與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的生物活性。四種不同品種的山藥水層粗抽物個(gè)別

2、的被製備出來，並且進(jìn)一步再分成Dx-A、Dx-B、Dx-C等三個(gè)子分層。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種的山藥與子分層對(duì)於刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生的能力也都不同。其中只有一個(gè)特定品種的Dx-B對(duì)於IL-2刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生具有顯著加乘作用。在活體(in vivo)實(shí)驗(yàn)方面，將老鼠以5-fluorouracil (5-FU)處理後(100 mg/kg body weight)再餵食山藥(10 mg/kg body weight)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山藥能恢復(fù)免疫受損老鼠的骨髓細(xì)胞或組織所受到的傷害。從群落形成分析法(Colony Forming Unit; CFU)比較餵食Dx-A、Dx-B與水的結(jié)果顯示，Dx-B

3、會(huì)專一性的刺激老鼠骨髓中的CFU-GM前趨細(xì)胞大量增生。這些結(jié)果支持以下的結(jié)論 : 從山藥品種四號(hào)中所萃取出來的Dx-B未來可能進(jìn)一步研發(fā)為健康食品或應(yīng)用成為免疫治療或化學(xué)治療的佐劑。關(guān)鍵字: 山藥，免疫力，細(xì)胞激素，免疫治療，化學(xué)治療，骨髓，健康食品，佐劑前言自古至今，國防的力量都是從人開始，沒有強(qiáng)健的體魄，即使船堅(jiān)砲利，戰(zhàn)力也會(huì)大打折扣，因此我們的研究方向，就是從如何增強(qiáng)人體免疫力來與國防研究接軌。草藥在現(xiàn)代應(yīng)用的範(fàn)圍愈來愈廣泛，從營養(yǎng)補(bǔ)充劑、健康食品、醫(yī)用藥物到佐劑，處處可見草藥的蹤影，尤其中國自古就有悠久的草藥應(yīng)用歷史，因此我們希望能從古書上既有的草藥中，以現(xiàn)代免疫學(xué)與細(xì)胞學(xué)科技，找出

4、可能增強(qiáng)人體免疫力的草藥。山藥是一種中國傳統(tǒng)上廣泛使用的草藥，民間傳說可以促進(jìn)健康以及增強(qiáng)免疫力，然而這項(xiàng)傳說缺乏現(xiàn)代科學(xué)證據(jù)，因此我們選擇山藥作為研究對(duì)象，以冷水萃取可溶性物質(zhì)後，用不同濃度的酒精將物質(zhì)分層，找出有可能增強(qiáng)人體免疫力的分層，再進(jìn)一步探討可能機(jī)制。研究方法山藥萃取將新鮮山藥去皮洗淨(jìng)切片後，冷凍乾燥3天，然後研磨成粉，每20g加入100ml無菌水?dāng)嚢?小時(shí)，離心後取上清液，依序加入酒精至最終濃度為50%、75%與87.5%，離心後的沉澱物分別為Dx-A、Dx-B與Dx-C。老鼠脾臟細(xì)胞與骨髓細(xì)胞取得將老鼠脾臟取出置於組織研磨器中研磨，取得之細(xì)胞以ACK Buffer處理後，置於R

5、PMI培養(yǎng)液中，再通過棉花管去除組織團(tuán)塊，所得之脾臟細(xì)胞置於冰上備用(1)。將老鼠大、小腿骨取出，利用25G針頭以RPMI培養(yǎng)液沖出骨髓細(xì)胞，再以微量吸管溫和的吸放，令骨髓細(xì)胞均勻懸浮於培養(yǎng)液中，置冰上備用(2,3)。細(xì)胞增生分析在96孔培養(yǎng)盤中每孔種2X105老鼠脾臟細(xì)胞，再分別加入藥物，置於CO237培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，每孔再加入1mCi的3H-Thymidine，再於37繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)後，洗去細(xì)胞外的多餘Thymidine，然後偵測每孔的放射活性。老鼠活體處理以腹腔注射法將100 mg / kg mouse的5-Fluorouracil注入老鼠體內(nèi)(4)，靜待24小時(shí)後，每天一次，連

6、續(xù)五天分別灌食無菌水、蔬菜汁、Dx-A與Dx-B(10mg / kg mouse)。細(xì)胞群落形成單位分析將老鼠骨髓細(xì)胞適量種入細(xì)胞群落形成培養(yǎng)液中，置於CO237培養(yǎng)箱12天，然後置於顯微鏡底下觀察並計(jì)算不同細(xì)胞群落的數(shù)目。結(jié)果為了判斷山藥抽出物中，哪個(gè)分餾層具有影響免疫系統(tǒng)的活性，因此將三個(gè)分餾層分別處理老鼠脾臟細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dx-B能明顯刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生，Dx-C也有類似效果，卻不如Dx-B明顯(圖一)，因此我們接下來選擇Dx-B為研究材料。為了尋找Dx-B刺激老鼠脾臟增生的機(jī)制，我們選擇刺激脾臟細(xì)胞增生的機(jī)制很清楚的interleukin-2(IL-2)作為標(biāo)準(zhǔn)(5,6)，將Dx-B

7、與IL-2共同處理老鼠脾臟細(xì)胞，如果兩者的機(jī)制相同，則刺激增生的效果應(yīng)該也會(huì)等於個(gè)別效果相加之和，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共同處理的效果明顯高於個(gè)別處理的效果之和達(dá)四倍(圖二)，因此判斷Dx-B刺激老鼠細(xì)胞增生的機(jī)制與IL-2並不相同，且能與IL-2有相乘效果。為了想了解刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生的活性是否普遍存在於不同品種的山藥中，於是抽取不同品種的山藥Dx-B比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有兩種有此活性，其中以四號(hào)品種效果最顯著(圖三)，所以可知該刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生的成分只存在於部分山藥品種中。由於活體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果並不表示也能在活體內(nèi)發(fā)生，因此先利用5-fluorouracid (5-FU)降低老鼠骨髓內(nèi)的有核細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量

8、，然後再分別連續(xù)五天灌食山藥，比較灌食水與灌食山藥的老鼠(4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌食Dx-B的老鼠骨髓與脾臟細(xì)胞中的有核細(xì)胞數(shù)目明顯高於只灌食水的老鼠(圖四)。將5-FU處理過的老鼠灌食蔬菜汁，然後計(jì)算骨髓中有核細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然蔬菜汁稍微幫助老鼠骨髓中有核細(xì)胞數(shù)，但是不如Dx-B顯著(圖四)，因此可以確定此現(xiàn)象並非是由如細(xì)胞壁等等植物普遍存在的成分所造成，此結(jié)果支持山藥中確實(shí)含有特別成份能幫助恢復(fù)老鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)量的想法。為了了解Dx-B幫助老鼠骨髓中有核細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)的可能機(jī)制，因此將老鼠如前處理後，骨髓細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞群落形成單位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有以Dx-B灌食後才能顯著增加CFU-GM數(shù)量，

9、BFU-E與CFU-GEMM則微量增加，以Dx-A或蔬菜汁灌食後無顯著差異(表一)。討論本研究證明山藥不但能刺激免疫細(xì)胞增生，且在刺激脾臟細(xì)胞增生方面能與IL-2產(chǎn)生加成效果，此結(jié)果暗示山藥具有免疫調(diào)節(jié)效果，且可能在臨床上可以與IL-2配合，降低IL-2用量而得到相同效果。由於此效果並非普遍存在於所有山藥品種中，因此可以判斷具該效果的成分絕非一般植物都有，且只有某些山藥品種才有此種成分。在5-FU處理過而降低骨髓與脾臟有核細(xì)胞數(shù)目的老鼠中，餵食山藥確實(shí)能回幫助恢復(fù)老鼠脾臟與骨髓中有核細(xì)胞的數(shù)目，而且此效果可能是山藥所特有，此結(jié)果暗示山藥能幫助受損害的活體免疫系統(tǒng)儘速恢復(fù)正常狀態(tài)，例如癌癥病人接

10、受化療後，可能可以藉由山藥來縮短免疫力的空窗期。進(jìn)一步將實(shí)驗(yàn)後的老鼠骨髓有核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞群落形成分析，可以發(fā)現(xiàn)山藥有促進(jìn)CFU-GEMM往CFU-GM分化的趨勢，而BFU-E無顯著差異。綜合以上結(jié)果，我們提出山藥可能藉由促進(jìn)CFU-GM生成來幫助骨髓中有核細(xì)胞數(shù)量回復(fù)的假設(shè)(圖五)。由於CFU-GM可以進(jìn)一步分化成為單核球、巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等免疫系統(tǒng)第一線防禦主角(7,8)，這些細(xì)胞的增加可能暗示體內(nèi)免疫常駐防禦部隊(duì)的增加，活體可能因此提高免疫力，更不容易遭受外來病菌的侵害。就免疫系統(tǒng)受損方面，山藥可能幫助活體盡快恢復(fù)正常的免疫力，就正常免疫系統(tǒng)方面，活體也可能藉此提昇免疫能力。結(jié)論國防

11、的基礎(chǔ)在於人，有強(qiáng)健的體魄，才有堅(jiān)強(qiáng)的作戰(zhàn)能力，能加快恢復(fù)健康速度，才能在最短時(shí)間恢復(fù)受損的戰(zhàn)力。我們的研究成果，能有效並高度闡明山藥不論在進(jìn)食(體內(nèi))或體外細(xì)胞治療方面，都有很好的潛能逐步在未來發(fā)展為健康食品或助化療之佐劑。圖表圖一403020100100050025010050濃度 (mg/ml)3H-Thymidine活性 (X 10-3CPM) CPM)Dx-ADx-BDx-C比較山藥不同分餾層刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生效果。細(xì)胞增生量以3H-thymidine標(biāo)定?？梢园l(fā)現(xiàn)Dx-B效果最顯著。圖二Dx-BDx-B + IL-2Dx-B與IL-2數(shù)值總合0510152025300501002

12、50500山藥濃度 (mg/ml)3H-Thymidine活性 (X10-3 CPM)觀察Dx-B與Il-2共同刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生的效果。由圖中可以發(fā)現(xiàn)Dx-B與IL-2共同處理後，具有加乘效果。6圖三3H-Thymidine活性 (X 10-3 CPM)0241012141618品種一號(hào)品種二號(hào)品種三號(hào)品種四號(hào)山藥品種別Dx-BDx-B + IL-2Dx-B與IL-2數(shù)值總合8比較不同品種的山藥Dx-B刺激老鼠脾臟細(xì)胞增生的效果。只有我們所用的品種四號(hào)具有明顯效果。圖四00.40.81.21.62.0有核細(xì)胞數(shù)(X10-7)PBS5-FU水水蔬菜汁Dx-B受5-FU損傷的老鼠脾臟與骨髓有核

13、細(xì)胞數(shù)量在灌食山藥後的影響。灌食Dx-B的老鼠骨髓中，有核細(xì)胞數(shù)較未餵食的老鼠高。且?guī)椭鲜蠊撬柚杏泻思?xì)胞數(shù)恢復(fù)的成分並非普遍存在於植物中。PBS為磷酸緩衝鹽液(Phosphate-Buffered Saline)。表一比較不同處理對(duì)於受5-FU損傷的老鼠骨髓細(xì)胞中各種前趨細(xì)胞數(shù)目的影響。 其中數(shù)字表示每隻老鼠的大腿骨與小腿骨中骨髓內(nèi)細(xì)胞數(shù)目。不同處理 CFU數(shù)目(X10-2)/腿 GM BFU-E GEMM-5-FU+水 622.683.6 17.86.9 12.85.5+5-FU+水 336.243.7 7.40.6 6.70.1+蔬菜汁 464.545.2 11.22.3 10.11.5

14、+Dx-A 491.947.3 8.63.0 11.23.5+Dx-B 855.7132.1 12.92.4 13.62.2圖五PluripotentStem CellPlateletsCFU-MegMyeloid ProgenitorCFU-GEMMRBCBFU-EDx-B骨髓CFU-GMGranulocyteMonocyte綜合以上結(jié)果，我們對(duì)於解釋山藥能幫助恢復(fù)老鼠骨髓中有核細(xì)胞數(shù)目的假設(shè)。我們認(rèn)為山藥可能可以促進(jìn)前趨細(xì)胞CFU- GEMM分化成CFU-GM，藉此提昇CFU-GM的數(shù)量來增加有核細(xì)胞數(shù)目。誌謝本研究承國科會(huì)之贊助，核準(zhǔn)編號(hào) : 91-2317-B-001-008。參考文獻(xiàn)

15、1.Coligan JE, Kruisbeek AM, Margulies DH, Shevach EM, Strober W. editors. Current Protocols in Immunology. New York: John Wiley & Sons, Inc. 1998. 2.Randall TD, Weissman IL. Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment. Bloo

16、d. Vol. 89, pp. 3596-606(1997).3.Wlodarski P, Wasik M, Ratajczak MZ, Sevignani C, Hoser G, Kawiak J, et al. Role of p53 in hematopoietic recovery after cytotoxic treatment. Blood. Vol. 91, pp. 2998-3006(1998).4.Cao X, Cai R, Ju DW, Tao Q, Yu Y, Wang J. Augmentation of hematopoiesis by fibroblast-med

17、iated interleukin-6 gene therapy in mice with chemotherapy. J Interferon Cytokine Res. Vol. 18, pp. 227-33(1998).5.Gollob JA, Schnipper CP, Murphy EA, Ritz J, Frank DA. The functional synergy between IL-12 and IL-2 involves p38 mitogen-activated protein kinase and is associated with the augmentation

18、 of STAT serine phosphorylation. J Immunol. Vol. 162, pp. 4472-81(1999).6.Karnitz LM, Burns LA, Sutor SL, Blenis J, Abraham RT. Interleukin-2 triggers a novel phosphatidylinositol 3-kinase- dependent MEK activation pathway. Mol Cell Biol. Vol. 15, pp. 3049-57(1995).7.Majumdar MK, Banks V, Peluso DP, Morris EA. Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells. J Cell Phy