基因芯片的必備知識(shí)和操作流程

1、基因芯片技術(shù)的誕生為生物技術(shù)工作人員打開(kāi)了一道科研的便利之門(mén), 曾被評(píng)為 1998年年度十大科技進(jìn)展之一。 本文對(duì)基因芯片的實(shí)驗(yàn)原理、 技術(shù)基礎(chǔ)、 分類(lèi)、 用途、操作主要環(huán)節(jié)等內(nèi)容做詳細(xì)的介紹。基因芯片技術(shù)的誕生為生物技術(shù)工作人員打開(kāi)了一道科研的便利之門(mén), 曾被評(píng)為 1998年年度十大科技進(jìn)展之一。 本文對(duì)基因芯片的實(shí)驗(yàn)原理、 技術(shù)基礎(chǔ)、 分類(lèi)、 用途、操作主要環(huán)節(jié)等內(nèi)容做詳細(xì)的介紹。1. 基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)基因芯片以 DNA 雜交為基本原理,基于 A 和 T 、 G 和 C 的互補(bǔ)關(guān)系。它是在探針 的基礎(chǔ)上研制出的。所謂探針是一段人工合成或篩選出的已知順序的堿基序列, 樣品分子上連接有一些

2、cy3、 cy5等可檢測(cè)的物質(zhì)。經(jīng)激光共聚焦熒光顯微鏡檢 出雜交或反應(yīng)信號(hào),通過(guò)計(jì)算機(jī)處理、分析,即可獲得所需信息。例如,用紅、 綠熒光分別標(biāo)記實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本的 cDNA ,混合后與微陣列雜交,可顯示實(shí) 驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本基因的表達(dá)強(qiáng)度 (顯示紅色、 綠色或黃色 , 由此可在同一微陣 列上同時(shí)檢測(cè)兩樣本的基因表達(dá)差 異。在基因芯片工作過(guò)程中,固定位點(diǎn)使用 不同分子生物學(xué)技術(shù)和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與待測(cè)基因片段雜交, 并通過(guò)自動(dòng)閱讀 設(shè)備分析雜交結(jié)果,達(dá)到定性、定量分析 的目的?；蛐酒ㄟ^(guò)應(yīng)用平面微細(xì) 加工技術(shù)和超分子自組裝技術(shù), 把大量分子檢測(cè)單元集成在一個(gè)微小的固體基片 表面, 可同時(shí)對(duì)大量

3、的核酸等生物分子實(shí)現(xiàn)高 效、 快速、 低成本的檢測(cè)和分析?；蛐酒臋z測(cè)主要建立在放射標(biāo)記技術(shù)、 熒光標(biāo)記技術(shù)、 質(zhì)譜分析、 化學(xué)發(fā)光 等技術(shù)上。 使用熒光標(biāo)記的基因芯片需要專(zhuān)用的熒光掃描儀。 對(duì)于高密度的基因 芯 片,目前最常用的是激光共聚焦顯微鏡和高性能的冷卻 CCD 。目前專(zhuān)用于熒 光掃描的掃描儀大致分為兩類(lèi):一類(lèi)是基于 CCD(charge-coupled device ,電荷 耦合裝置 的檢測(cè)光子 ; 另一類(lèi)則是基于 PMT(photomultiplier tube,光電倍增 管 的檢測(cè)系統(tǒng)。生物芯片的發(fā)展得益于微細(xì)加工技術(shù)和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的結(jié)合。 隨著人類(lèi)基因 組計(jì)劃的實(shí)施, 現(xiàn)

4、代分子生物技術(shù)也取得了巨大突破:體外基因擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 核酸 樣品的快速制備和放大,基因擴(kuò)增后可進(jìn)行基因測(cè)序,而基因探針技術(shù)使 得基因測(cè)序的檢測(cè)自動(dòng)化成為可能, 極大地促使了生物芯片的發(fā)展。 微陣列的加 工借助的是 微電子工業(yè)中應(yīng)用十分成熟的光學(xué)光刻技術(shù)和微機(jī)電系統(tǒng)加工中所 采用的各種方法, 根據(jù)要求在玻璃、 塑料、 硅片等基底材料上加工出用于生物樣 品分離、反應(yīng)的各 種微細(xì)結(jié)構(gòu),然后在微結(jié)構(gòu)上施加表面化學(xué)處理。光學(xué)光刻 的第一步是通過(guò)光學(xué)制板照相制備掩模。 制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻 璃板,該鉻層事先已按微 細(xì)結(jié)構(gòu)的圖形被刻蝕成透光和不透光兩個(gè)部分。第二 步是光刻, 讓掩模與表面涂有

5、光刻膠的硅片接觸, 然后讓光源通過(guò)掩模照射到硅 片上。通過(guò)顯影光刻膠中的圖 形,使其上未被掩模遮掩的部分被溶解除去。上 述工作完成之后, 通過(guò)對(duì)無(wú)膠保護(hù)的硅片用腐蝕劑蝕刻, 再去除剩余的光刻膠便 可獲得所需生物芯片的微細(xì)結(jié)構(gòu)。微 米級(jí)甚至納米級(jí)的微細(xì)加工技術(shù)使得數(shù)以萬(wàn)計(jì)的生物探針 (DNA片段、 抗原和抗體 等微觀結(jié)構(gòu)成功地排列在很小的芯片載 體上,從而保證了生物芯片檢測(cè)的集成 化、微型化和高通量化。2. 基因芯片的分類(lèi)基因芯片是分子生物學(xué)和微細(xì)加工技術(shù) (micro fabrication technology 相結(jié)合 的產(chǎn)物, 分類(lèi)方法有多種。 分類(lèi)的依據(jù)主要有制作方法、載體材料、 載體上

6、所固 定的 DNA 的種類(lèi)、用途等。1 根據(jù)制作方法, 可將基因芯片分為原位合成芯片與合成后點(diǎn)樣芯片 (王升啟等, 1999 。前者利用光引導(dǎo)聚合技術(shù) (1ight-directed synthesis或壓電打印法 (piezoelec-tric printing 進(jìn)行原位合成寡聚核苷酸探針,以美國(guó) Affymetrix 公司的芯片產(chǎn)品為代表 ; 后者主要利用微型機(jī)械點(diǎn)樣法或化學(xué)噴射法將合成好的 探針、 cDNA 或基因組 DNA 通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器直接點(diǎn)在芯片片基上。2 根據(jù)芯片上固定的探針數(shù)量, 可以將基因芯片分為高密度芯片和中低密度芯片 兩類(lèi)。 高密度芯片上的探針數(shù)量從幾萬(wàn)到上百萬(wàn),

7、 主要是通過(guò)原位合成制備的寡 核苷酸芯片, 以及通過(guò)將數(shù)萬(wàn)個(gè)基因或者 EST 序列的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物直接點(diǎn)至芯片 上制備的 cDNA 芯片。高密度基因芯片主要用于大規(guī)模的基因表達(dá)譜測(cè)定、藥物 篩選和新藥開(kāi)發(fā)、 基因功能探索等方面。 中低密度芯片中探針的數(shù)目一般在幾十 到幾千不等,一般是通過(guò)合成后點(diǎn)樣制備的芯片,主要用于基因突變分 析、基 因表達(dá)譜分析等領(lǐng)域。 基因芯片的主要特點(diǎn)是高通量。 實(shí)際上中低密度芯片是基 因芯片在臨床應(yīng)用上的發(fā)展趨勢(shì), 原因主要是以下兩點(diǎn):盡管多數(shù)疾病的影 響 因素很多,但是在診斷和鑒別中的目的是具體的,所以檢測(cè)需要低通量的;中 低密度芯片檢測(cè)的指標(biāo)較少, 各指標(biāo)問(wèn)的

8、相互影響作用較小, 在制作工藝和檢測(cè) 結(jié) 果上更能保證準(zhǔn)確性。3 根據(jù)芯片上探針的不同,可將基因芯片分為寡核苷酸芯片和 cDNA 芯片。寡 核苷酸芯片:用照相平版印刷術(shù) (photolithography和固相 合成術(shù)結(jié)合在基片 上生成寡核苷酸,由 Fodor 首先在 1991年報(bào)道。該技術(shù)是先在玻片上涂上光敏 化學(xué)材料,蓋上罩,根據(jù)所要合成的堿基序列決定罩的透光 位點(diǎn)。光照局部產(chǎn) 生去防護(hù)作用,用所需核苷酸沖洗玻片,該核苷酸即在去防護(hù)部位粘合于玻片。 核苷酸的 5 端修飾以光不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán),該基團(tuán)經(jīng)光照而去保 護(hù),與下一個(gè) 核苷酸結(jié)合。如此重復(fù)直至獲得所需核苷酸長(zhǎng)度。每一層各點(diǎn)的 A 、

9、T 、 C 、 G 不 同, 故每合成一層核苷酸需要 4個(gè)不同透光位點(diǎn)的罩和 A 、 T 、 C 、 G分別沖洗一 次。通過(guò) 4n次步驟可合成含有 n 個(gè)核苷酸的寡核苷酸鏈。其主要特點(diǎn)是可按 需要設(shè)計(jì)一定序列的寡核苷酸鏈。美國(guó)的 Affymetrix 公司已 能生產(chǎn) 40萬(wàn)個(gè)寡 核苷酸 /1.6cm2的芯片。cDNA 芯片:將特定的或文庫(kù)的 cD-NA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后 用機(jī)械手點(diǎn)到基片上。 最先由 Schena 于 1995年報(bào)道。 美國(guó) Synteni 公司的 cDNA 微陣列已達(dá) 104cDNA/3.6cm2。4 根據(jù)芯片用途, 可以將芯片分為基因表達(dá)譜芯片、 測(cè)序芯片、 診斷芯片等。

10、 基 因表達(dá)譜芯片技術(shù)是一種領(lǐng)先的研究方法。 例如, 通過(guò)對(duì)人類(lèi)基因組中成千上萬(wàn) 個(gè) 基因的表達(dá)水平進(jìn)行高通量檢測(cè)來(lái)尋找具有差異的基因表達(dá),從而預(yù)測(cè)個(gè)體 患者的病程發(fā)展及治療效果,以最終實(shí)現(xiàn)疾病的個(gè)體化治療。 DNA 測(cè)序芯片則是基于雜 交測(cè)序發(fā)展起來(lái)的,其原理是任何線狀的單鏈 DNA 或者 RNA 序列均可以 分解成一系列堿基數(shù)固定、 錯(cuò)落而重疊的寡核苷酸, 又稱(chēng)為亞序列, 如果能把原 序列所有 的錯(cuò)落重疊的亞序列全部測(cè)出,就可以據(jù)此組建出原序列。5 根據(jù)載體材料不同,可將基因芯片分為尼龍膜、玻璃片、塑料片、硅膠晶片、 微型磁珠等。3. 基因芯片的主要技術(shù)環(huán)節(jié)基因芯片技術(shù)能夠提供極為豐富的信

11、息, 但其操作流程并不復(fù)雜。 應(yīng)用基因芯片 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程主要包括以下 4個(gè)環(huán)節(jié)。其基本要點(diǎn)為:芯片方陣的構(gòu)建、 樣品的制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)及分析。1. 方陣的構(gòu)建1 探針的制備。 芯片的類(lèi)型不同, 制備探針的方法也不盡相同。 如果是檢測(cè)表達(dá) 譜,需要從待檢測(cè)樣品 mRNA 或者總 RNA 中制備 cDNA 探針 ; 如果是 SNP 檢測(cè),則 需要從待檢測(cè)樣品 DNA 中通過(guò) PCR 制備探針或者人工合成寡核苷酸探針。2 片基處理。 目前制備芯片主要采用表面化學(xué)的方法或組合分類(lèi)化學(xué)的方法來(lái)處 理片基,然后使 DNA 片段按順序排列在芯片上。經(jīng)特殊處理過(guò)的玻璃片、硅片、 聚丙烯膜、 硅

12、膠晶等都可作為載體材料。 探針的固定化方法目前常用兩種:寡聚 賴(lài)氨酸法、 醛基一氨基法, 其他方法 (如巰基一雙硫鍵法 也在研究中。 固定化的 效 率也不同。3 點(diǎn)樣。 因芯片種類(lèi)較多, 點(diǎn)樣方法也不盡相同, 但基本上可分為原位合成與微 矩陣點(diǎn)樣兩大類(lèi)。 原位合成是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法, 具體 又 可分為光引導(dǎo)原位合成、噴墨打印和分子印跡原位合成三種方法。這三種技 術(shù)所依據(jù)的固相合成原理相似, 只是在合成前體試劑定位方面采取了不同的解決 辦法,由 于原位合成的短核酸探針陣列具有密度高、雜交速度快、效率高等優(yōu) 點(diǎn), 而且雜交效率受錯(cuò)配堿基的影響很明顯, 所以原位合成的 DNA 微

13、點(diǎn)陣適合于 進(jìn)行突變檢 測(cè)、多態(tài)性分析、表達(dá)譜檢測(cè)、雜交測(cè)序等需要大量探針和高的雜 交嚴(yán)謹(jǐn)性的實(shí)驗(yàn)。微矩陣點(diǎn)樣法是將 PCR 等得到的。 DNA 或生物分子用針點(diǎn)或 噴射的方法直 接排列到載體上。該方法在多聚物的設(shè)計(jì)方面與前者相似,合成 工作用傳統(tǒng)的 DNA 合成儀完成, 只是合成后用特殊的自動(dòng)化微量點(diǎn)樣裝置將其以 比較高的密度涂布 于芯片載體上。2. 樣品的制備生物樣品是復(fù)雜的生物分子混合體, 一般不能直接與芯片反應(yīng), 必須將樣品進(jìn)行 生物處理。 對(duì)于基因芯片, 組織中獲取的 DNA/mRNA樣品必須通過(guò)擴(kuò)增 (PCR以提 高檢測(cè)的靈敏度。1 細(xì)菌性樣本。 檢測(cè)的對(duì)象如果是細(xì)菌性樣本, 在必

14、要的情況下, 首先應(yīng)該進(jìn)行 增菌處理,然后使用合適的方法提取樣本中的 DNA ,設(shè)計(jì)特異或通用的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,使樣品分子標(biāo)記上可以檢測(cè)的熒光分子。美國(guó) Mosaic 技術(shù)公司發(fā)展 的一種固相 PCR 系統(tǒng)包含兩套引物, 每套引物都可從靶基因兩頭延伸 (Chang et a1. , 2004 。當(dāng)引物和 DNA 樣品及 PCR 試劑相混時(shí),如果樣品包含靶序列, DNA 就從引物兩頭開(kāi)始合成, 并在引物之間形成雙鏈 DNA 環(huán)。 由于上述反應(yīng)在固相中 產(chǎn)生,避免了引物競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象,并可減少殘留物污染和重復(fù)引發(fā)。2 病毒性樣本。如果待檢樣本是病毒, DNA 病毒的操作過(guò)程與細(xì)菌性樣本的操作 過(guò)程

15、相似,而 RNA 病毒則需要加入一個(gè) RT-PCR 過(guò)程。目前,已有多種 PCR 方法 廣泛使用,目的是提高擴(kuò)增效率和特異性,如 TouchDown PCR、巢式 PCR 、長(zhǎng)距 離 PCR 等。3. 雜交反應(yīng)樣品與芯片的雜交反應(yīng)中涉及的因素主要有雜交溫度、 雜交時(shí)間、 雜交液的成分 等。 生物分子反應(yīng)是生物芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步, 其復(fù)雜的程度 和具 體控制條件由芯片中基因片段的長(zhǎng)短和芯片本身的用途而定。如果是基因 表達(dá)檢測(cè), 反應(yīng)時(shí)需要高鹽濃度、 低溫和長(zhǎng)時(shí)間。 如果要檢測(cè)是否有突變, 因涉 及單個(gè)堿基 的錯(cuò)配,故需要在短時(shí)間內(nèi)、低鹽、高溫條件下高特異性雜交。4. 信號(hào)的檢測(cè)和分析信號(hào)檢測(cè)與分析即對(duì)生化反應(yīng)所得結(jié)果的分析測(cè)定。 基因芯片在與熒光標(biāo)記的目 標(biāo) DNA 或 RNA 雜交后, 必須用激光共聚焦掃描芯片和 CCD 芯片掃描儀將芯片測(cè) 定 結(jié)果轉(zhuǎn)變成可供分析處理的圖像數(shù)據(jù),此方法重復(fù)性好,但是靈敏度相對(duì)較低。 目前正在研究的替代方法有質(zhì)譜法、 化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖