大腸桿菌表達(dá)的重組人BMP

1、大腸桿菌表達(dá)的重組人BMP             作者：王濤，陳蘇民，陳南春，趙偉欽，張曉楠 【關(guān)鍵詞】  重組人骨形成蛋白4成熟肽；重組人骨形成蛋白2成熟肽；發(fā)酵；蛋白質(zhì)類/分離和提純Comparison of largescale preparation of recombinant human BMP4 and BMP2 mature peptide expressed in E.coli【Abstract】 AIM: To prepare pure hum

2、an bone morphogenetic protein mature peptide (rhBMP4m and rhBMP2m)in large scale. METHODS: The rhBMP4m and rhBMP2m engineering strains were fermented and induced for expression in 15L NBS fermenter respectively and the bacterial cells were collected by centrifugation. Then the bacterial cells were l

3、yzed and the resulting inclusion bodies were washed for 4 times. After obtaining data from preexperiments, all inclusion  bodies were dissolved in 8 mol/L urea buffer and loaded on SPSepharose FF column. RESULTS: At the end of fermentation, A600 nm values of the two bacterial cultures were 28.8

4、 and 26.3. SDSPAGE analysis showed that rhBMP4m occupied 40% of the total bacterial proteins while that of rhBMP2m was 47.2%. rhBMP4m and rhBMP2m accounted for 82.9% and 84.5% of  the total proteins of the inclusion bodies respectively. After loaded on SPSepharose FF column, rhBMP4m and rhBMP2m

5、 were eluted out in 0.35  and 0.20 mol/L NaCl fractions and the purity reached 96% and 95% with the harvest of 1.30  and 1.25 g/L fermentation liquid and the recovery rate were 34.33% and 34.81%, respectively. CONCLUSION:  It could use the same fermentation program and the similar tec

6、hniques to prepare pure rhBMP4m and rhBMP2m in large scale.【Keywords】  recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide (rhBMP4m);  recombinant human bone morphogenetic protein 2 mature peptide (rhBMP2m);   fermentation; proteins/isolation purification【摘要】 目的： 大規(guī)模制備人

7、骨形成蛋白成熟肽（hBMPm）：hBMP4m和hBMP2m. 方法： 兩種工程菌株分別含有能夠高表達(dá)hBMP4m和hBMP2m的質(zhì)粒，分別導(dǎo)入15 L NBS發(fā)酵罐中進(jìn)行恒溶氧高密度發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體, 懸浮所收集的菌體，裂菌，洗滌4次. 預(yù)先取少量樣品進(jìn)行探索實驗后，全部包涵體分別用8 mol/L尿素緩沖液溶解，上Sepharose SPFF陽離子柱. 結(jié)果： 發(fā)酵菌液A600 nm值分別為28.8和26.3. SOSPAGE電泳后吸光度掃描表明hBMP4m占細(xì)菌總蛋白量的40.0%, hBMP2m占細(xì)菌總蛋白量的47.2%. 洗滌4次后的包涵體中hBMP4m占蛋白量的82.9%,

8、 hBMP2m占蛋白量的84.5%. 上Sepharose SPFF陽離子柱后，分別收集0.35 mol/L NaCl和0.20 mol/L NaCl洗脫部分，獲得純度為96%的hBMP4m及純度為95%的hBMP2m. 其收獲量分別為1.30 g/L發(fā)酵液和1.25 g/L發(fā)酵液；收得率分別為34.33和34.81. 結(jié)論： 大規(guī)模制備hBMP4m和hBMP2m時，使用相同的發(fā)酵程序及相近的純化方法，都能夠得到較好的收得率、較高的收獲量和純度. 【關(guān)鍵詞】  重組人骨形成蛋白4成熟肽；重組人骨形成蛋白2成熟肽；發(fā)酵；蛋白質(zhì)類/分離和提純0引言骨形成蛋白（bone morp

9、hogenetic protein, BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF超家族，是一類多功能的分化因子，構(gòu)成一個結(jié)構(gòu)和功能相似的家族，由于可以誘導(dǎo)異位成骨而被命名，是骨骼系統(tǒng)正常發(fā)育所必不可少的1. 而近年來的研究表明，BMPs在胚胎發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及造血系統(tǒng)等方面也具有重要作用和廣泛的臨床應(yīng)用前景2-3. 我們在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)制備出有良好誘導(dǎo)成骨活性的人rhBMP2成熟肽（rhBMP2 mature peptide, rhBMP2m）4-5和用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)制備有良好生物學(xué)活性的rhBMP4m6（國家專利申請?zhí)枺?00410073165.8）的基礎(chǔ)上，使用已經(jīng)構(gòu)建好的高表達(dá)rhBMP4m和

10、rhBMP2m的大腸桿菌工程菌株4-6，用已比較成熟的制備rhBMP2m的流程，來比較兩者大規(guī)模發(fā)酵、純化的效果，旨在為rhBMP4m的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料工程菌株DH5/pDH2BMP4m和DH5/pDH2BMP2m由第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室構(gòu)建并保存. 15 L全自動發(fā)酵罐購自美國NBS公司；Monitor UV1和 陽離子交換劑SPSepharose FF購自美國Pharmacia公司；玻璃層析柱購自上海錦華玻璃儀器廠，填料自裝. 透析膜（截留分子量10 000）購自洛陽華美公司；超聲細(xì)胞粉碎儀JY983購自寧波新芝科儀研究所；低溫高速離心機購自

11、湖南湘西儀器儀表廠. 溶菌酶，DNAase購自美國 Invitrogen；去氧膽酸鈉購自上海伯奧生物科技有限公司；TritonX為美國FARCO CHEMICAL產(chǎn)品；氯化鎂，氯化鈉，醋酸鈉磷酸氫鈉，磷酸二氫鈉，尿素均為化學(xué)分析純，購自天津化學(xué)試劑六廠和沈陽化學(xué)試劑廠；Brandfod蛋白定量試劑為本實驗室配制；低分子量蛋白markers購自上海生化所. 1.2方法1.2.1rhBMP4m及rhBMP2m的高密度發(fā)酵取-70保存的DH5/pDH2hB4m及DH5/pDH2BMP2m工程菌株甘油菌種，劃LB瓊脂平板(含100 g Amp /mL)，32培養(yǎng)20 h. 分別挑單菌落入6

12、mL LB（含100 g Amp /mL）， 30搖床培養(yǎng)16 h. 轉(zhuǎn)入300 mL LB(含100 g Amp /mL)，30搖床培養(yǎng)10 h. 轉(zhuǎn)入15升發(fā)酵罐30培養(yǎng)，開啟NBS數(shù)模轉(zhuǎn)換器并連接計算機，由注入口向發(fā)酵罐內(nèi)注入300 mL菌種（此步保持無菌操作），接裝堿泵，啟動自動控制程序，設(shè)定30生長16 h，自動恒定控制氧溶量，自動流加16.5 mol/L氨水使pH值保持在7.0左右，攪拌速度在200800轉(zhuǎn)間受溶解氧的反饋調(diào)控，空氣流速8 L/min，由溶解氧控制分批補料的培養(yǎng). 生長16 h后取樣觀察發(fā)酵液密度，再升溫42誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后，結(jié)束發(fā)酵. 1.2.2裂菌、包

13、涵體洗滌按每克濕菌加入3 mL裂解緩沖液(蔗糖100 g/L,  pH 8.0 TrisHCl 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L),洗滌液，徹底分散菌體，充分懸浮后，加溶菌酶3 mg/克濕菌，充分?jǐn)嚢枞诮?；加?.1 mmol/L去氧膽酸鈉充分?jǐn)噭?，最后加? mg/mL DNasel攪勻，室溫放置至黏度降低，4離心13.4 g，15 min，收取沉淀. 按每克濕沉淀加入3 mL洗滌液（TritonX100 5 g/L， pH 8.0 TrisHCl 10 mmol/L, EDTA1 mmol/L），徹底分散，充分懸浮，于冰浴中超聲裂菌，4離心5.9 g，10 min

14、，收取沉淀. 再重復(fù)上述操作，共洗滌4次，最后收集蛋白沉淀. 1.2.3層析預(yù)實驗取少量洗滌后的包涵體溶于8 mol/L尿素pH 6.5上樣緩沖液(8 mol/L尿素，20 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH 6.5， 0.018 mmol/L巰基乙醇)中，上自行安裝的小Sepharose SPFF柱，以含01 mol/L NaCl的上樣緩沖液作連續(xù)線性梯度洗脫，收集不同鹽濃度的洗脫蛋白峰進(jìn)行電泳分析，探索得洗脫出目的蛋白時的NaCl濃度.  百事通 1.2.4Sepharose SPFF陽離子柱層析分離將洗滌后的包涵體溶解于適量 8 mol/L尿素pH 6.5上樣緩沖液中，攪拌

15、至充分溶解， 20離心，13.4 g, 20 min. 收集上清液，過Sepharose SPFF陽離子柱，依照預(yù)試驗結(jié)果用適當(dāng)濃度的NaCl洗脫，將所得洗脫液做好標(biāo)記后分別裝入透析袋中對無離子水（pH 6.5）透析24 h，更換外液3次. 透析結(jié)束后，收集各透析袋內(nèi)液，4離心，13.4 g, 20 min，將所得含目的蛋白的沉淀稱重后20凍存. 2結(jié)果2.1rhBMP4m及rhBMP2m 42誘導(dǎo)表達(dá)4 h蛋白表達(dá)情況發(fā)酵結(jié)束后，取出全部發(fā)酵液，取樣檢測A600 nm值分別為 28.8和26.3.  SDSPAGE電泳分析，目的蛋白rhBMP4m及rhBMP2m分別占細(xì)菌總蛋白量的

16、40.0%和47.2%（圖1）. 蛋白質(zhì)定量后測算rhBMP4m和rhBMP2m發(fā)酵液量分別為3.6 g/L和4.1 g/L. 發(fā)酵液經(jīng)4離心，5.9 g， 20 min，收得的菌體濕質(zhì)量分別為320 g和282.44 g.A：DH5/pDH2hB4m；B： DH5/pDH2hB2m. M： 低分子量蛋白markers; 1： 誘導(dǎo)4 h; 2： 未誘導(dǎo). 圖1發(fā)酵液誘導(dǎo)表達(dá)4 h后SDSPAGE電泳圖（略）2.2裂菌、包涵體洗滌結(jié)果收集所得包涵體沉淀，分別取樣作SDSPAGE分析. 結(jié)果顯示，目的蛋白（rhBMP4m及rhBMP2m）分別占細(xì)菌總蛋白量的82.9%和84.5%，計算洗滌后所得

17、目的蛋白總量分別為3.32 g/L及3.55 g/L發(fā)酵液（圖2）.2.3Sepharose SPFF陽離子柱層析分離收集rhBMP4m及rhBMP2m的洗脫峰，分別取沉淀樣品，作SDSPAGE分析. 結(jié)果顯示，rhBMP4m純度為96%，收獲量為1.24 g/L發(fā)酵液；rhBMP2m純度為95%，收獲量為1.43 g/L發(fā)酵液. 以高密度發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)4 h后的發(fā)酵液中目的蛋白含量為起點計算目的蛋白收獲率，其rhBMP4m收獲率為34.33%，rhBMP2m收獲率為34.81%（圖3）.A： pDH2hB4m;B： pDH2hB2m. 0: 洗滌前的樣品；M： 低分子量蛋白markers;1:

18、 洗滌1次后；2： 洗滌2次后；3： 洗滌3次后；4： 洗滌4次后.  圖2包涵體各次洗滌后樣品的SDSPAGE電泳圖（略）A： rhBMP4m;B：rhBMP2m. 1: 上柱前樣品；M: 低分子量蛋白markers;2:  目的蛋白洗脫峰液.圖3Sepharose SPFF柱層析目的蛋白洗脫峰液電泳圖（略）3討論BMP2和BMP4是BMP家族中的兩個重要成員，其氨基酸序列有86%的同源性且活性形式均為二聚體，決定了其性質(zhì)和功能的相似性. 基于這些特性，我們使用了相同的發(fā)酵、純化方法來大規(guī)模制備這兩種蛋白并得到了較為接近的結(jié)果4,6. 我們選擇由本組構(gòu)建的溫度誘

19、導(dǎo)型、非融合蛋白表達(dá)載體pDH2來構(gòu)建這兩個工程菌株，是考慮到避免殘留化學(xué)誘導(dǎo)劑對人體的損害和融合蛋白帶來的免疫源性；用pDH2表達(dá)多種蛋白質(zhì)表達(dá)水平又都比較高而且穩(wěn)定. 在發(fā)酵階段，誘導(dǎo)4 h后目的蛋白rhBMP4m和rhBMP2m分別占細(xì)菌總蛋白量的40.0%和47.2%，相差不大，可能的原因是：同一種載體表達(dá)兩種性質(zhì)和大小接近的蛋白（rhBMP4m為13.1 ku，rhBMP2m為12.9 ku），發(fā)酵過程中設(shè)置程序都是相同的，又采用相同的誘導(dǎo)條件，因而出現(xiàn)相似的表達(dá). 在包涵體洗滌階段，我們雖然使用了裂解緩沖液及溶菌酶并用去氧膽酸鈉充分破裂細(xì)菌的壁和膜，加入DNase I消化

20、核酸降低黏度等，盡量使懸浮洗滌充分. 然而在大規(guī)模制備操作時，這些還不足以裂解所有細(xì)菌，因此需要再加入洗滌液重新徹底分散懸浮和裂菌. 由圖2可見，隨著洗滌次數(shù)的增加，雜蛋白條帶減少了許多. 包涵體洗滌后，首選的是用陽離子交換柱層析. 與預(yù)期的一致，穿過峰很高，穿過峰液的A260 nm/A280 nm的比值接近2，表明不吸附在Sepharose SPFF柱上而被除去的，除了許多雜蛋白外還有不少的核苷酸類的物質(zhì)（包括RNA和酶解的DNA小片段），SDSPAGE分析表明其中不含目的蛋白. 如果先用陰離子交換柱，柱體積中將有相當(dāng)大部分被這些帶負(fù)電荷的核苷酸類物質(zhì)所占據(jù)，因而就要用大容積的陰離子交換柱，這在大規(guī)模分離中是很不利的. 先用陽離子交換柱就可以用小得多的離子交換柱. 從我們的實驗中也可以看到用陽離子交換柱層析得到很好的結(jié)果，一步層析獲得的rhBMP4m和rhBMP2m的純度就分別達(dá)到96%和95%. 上述實驗結(jié)果表明：本來用于大規(guī)模純化rhBMP2m的流程也基本能夠用于大規(guī)模純化rhBMP4m. 使用相同的發(fā)酵程序及相似的純化方法，都能夠在大規(guī)模制備rhBMP4m和rhBMP2m時，得到較好的收得率、較高的收獲量和純度. 這就為rhBMP4m的大量生產(chǎn)、供給和使用打下了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1  Woz