慢病毒載體包裝構(gòu)建過(guò)程

1、慢病毒載體包裝構(gòu)建過(guò)程原理：慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類(lèi)型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果。對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的 shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)。概念：慢病毒載體是指以人類(lèi)免疫缺陷病毒-1 (H IV-1)來(lái)源的一種病毒載體，慢病毒載體

2、包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分。攜帶有 外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的(2 molecjjlefl)(Can Stall)TriftirntmiKiw 訕靶即巾rM(MMiniar) Prot«n MASurf Mt Glrcoprltin $U 仲120慢病毒包裝質(zhì)粒和可產(chǎn)生病毒顆粒的細(xì)胞系。Lentivrrai Rnaj System病毒顆粒，通過(guò)感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。輔助成分：慢病毒載體輔助成分包括: 慢病毒載體包含了包裝、 轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳

3、信息。 慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械?轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒 顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中， 離心取得上清液后， 可以直接用于宿主細(xì)胞的感染， 目的基 因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。基本原理：慢病毒載體系統(tǒng)由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白。包裝成分通常被分開(kāi)構(gòu)建到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol

4、蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如人腎293T細(xì)胞），即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無(wú)復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。載體成分：與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5' LTR換成巨細(xì)胞病毒（CMV）立即早期啟動(dòng)子、3' LTR換成SV40 polyA等。邑裝豪休共轉(zhuǎn)舉包趙切脂并表達(dá)一、實(shí)驗(yàn)流程（1和2

5、為并列步驟）1慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%）從模板中（CDNA質(zhì)?；蛘呶膸?kù)）調(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequenee）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體。2慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體 3慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24和48h后，分別收集富含 慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上

6、清液通過(guò)超離心濃縮病毒。二、實(shí)驗(yàn)材料 2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（ GFP。載體信息 1）慢病毒克隆載體圖譜如下:pLVX-IRES-ZsGroon 1 Voctor Information2801CataPU.C oriWPRE ZsGreenElcoRISpotGTGAATTCCT CGAGACTAGTXbalHollEiarnl 11CACTTAAGGA GCTCTGATCATCTAGAGCGG AGATCTCGCCCCGCGGATCCGGCGCCTAGGpLVX IRES ZGrecnl Vector Map and Multiple Cloning Site (MCS).5 LTREzRIRnmHI2431 AAGGACGAGG ATCCGGACAA GC1TCGAA11 CIAGIIATIATTCCTGCTCC TAGGCCTGTT CGAAGCTTAA GATGGCCCAT2）包裝質(zhì)粒信息如下:PMD2G載體圖譜和序列信息PSPAX2載體圖譜和序列信息：