微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)(上課)

1、到目前為止，到目前為止， 幾十項(xiàng)幾十項(xiàng)nobel生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng)生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，化學(xué)獎(jiǎng) 都與微生物學(xué)有關(guān)都與微生物學(xué)有關(guān)微生物的類群微生物的類群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌單細(xì)胞的動(dòng)植物單細(xì)胞的動(dòng)植物如草履蟲、單細(xì)胞藻類等如草履蟲、單細(xì)胞藻類等無細(xì)胞結(jié)構(gòu)無細(xì)胞結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞真核細(xì)胞細(xì)菌、藍(lán)藻細(xì)菌、藍(lán)藻原核細(xì)胞原核細(xì)胞課題1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1.提供營(yíng)養(yǎng)和條件2.防止污染一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機(jī)鹽碳源、氮源、水、無機(jī)鹽碳

2、源碳源無機(jī)碳源：無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：有機(jī)碳源：coco2 2、coco3 32 2- -、hcohco3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物氮源氮源無機(jī)氮源：無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：有機(jī)氮源：nhnh4 4、nono3 3- -（為硝化細(xì)菌提供（為硝化細(xì)菌提供n n源和能源）源和能源）牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等注：含注：含chonchon的的有機(jī)物有機(jī)物是是異異養(yǎng)型微生物的養(yǎng)型微生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)微生物生存的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1.1.基本成分：基本成分：碳

3、源、氮源、水、無機(jī)鹽碳源、氮源、水、無機(jī)鹽2.2.特殊營(yíng)養(yǎng)特殊營(yíng)養(yǎng)：維生素、堿基等（生長(zhǎng)因子）維生素、堿基等（生長(zhǎng)因子）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.ph3.ph、氧氣的需求：、氧氣的需求：4.4.種類種類：固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有有無無 凝固劑瓊脂凝固劑瓊脂分離分離 鑒定鑒定工業(yè)工業(yè) 生產(chǎn)生產(chǎn)化學(xué)成分：化學(xué)成分：物理性質(zhì)：物理性質(zhì)：天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配

4、方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方h2o 定容至定容至1000mlnacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0g分析營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成？分析營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成？5. 5. 配制原則配制原則目的明確：目的明確：營(yíng)養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)營(yíng)養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當(dāng)適宜的適宜的phph值：值：有機(jī)碳源有機(jī)碳源異養(yǎng)型：異養(yǎng)型：根據(jù)微生物的根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的種類、培養(yǎng)目的選擇原料選擇原料自養(yǎng)型：自養(yǎng)型： 不加碳源不加碳源加入緩沖劑加入緩沖劑細(xì)菌偏堿，真菌偏酸細(xì)菌偏堿，真菌偏酸（coco2 2碳源）碳源）生產(chǎn)生產(chǎn)科研科研耐高溫需保持干燥的耐高溫需保持干燥的 物品，物品，160170 12小時(shí)小時(shí)接

5、種環(huán)、接種針等接種環(huán)、接種針等 金屬用具金屬用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒滅菌滅菌定義定義方法方法較為較為溫和溫和理化方法，理化方法，殺死殺死部分有害菌體部分有害菌體（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）強(qiáng)烈強(qiáng)烈的理化方法，的理化方法，殺死殺死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑化學(xué)藥劑紫外線紫外線灼燒滅菌灼燒滅菌干熱滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石炭酸等酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，100kpa、121、1530min二二. .無菌技術(shù)：無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染

6、防止外來雜菌的污染1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1 1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管（3 3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手實(shí)驗(yàn)操作者的雙手2.2.無菌范圍：無菌范圍：實(shí)驗(yàn)操作空間消毒實(shí)驗(yàn)操作空間消毒操作者的手、衣著消毒操作者的手、衣著消毒實(shí)驗(yàn)用具滅菌實(shí)驗(yàn)用具滅菌實(shí)驗(yàn)操作過程實(shí)驗(yàn)操作過程二二. .無菌技術(shù)：無菌技術(shù)：防止外來雜菌的污染防止外來雜菌的污染1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：

7、酒精燈旁操作酒精燈旁操作超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的形成一個(gè)橢圓形的休眠體休眠體，叫做芽孢。，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3 3小時(shí)以后才死小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌菌細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和植細(xì)

8、菌、原生動(dòng)物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的的生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞。能直接發(fā)育成。能直接發(fā)育成新個(gè)體。新個(gè)體。 單個(gè)單個(gè)或少數(shù)菌體或少數(shù)菌體2.2.特征：特征：大小、形狀、光澤度、大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。顏色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定義：定義：菌落菌落鑒定菌種鑒定菌種的重要依據(jù)的重要依據(jù)固體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上大量繁殖大量繁殖子細(xì)胞群體子細(xì)胞群體1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方h2o 定容至定容至1000mlnacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g瓊脂瓊脂20.0g三三. .大腸桿菌的純化培

9、養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.1.計(jì)算：計(jì)算：培養(yǎng)基用量培養(yǎng)基用量依配方計(jì)算各成分的用量依配方計(jì)算各成分的用量2.2.稱量：稱量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏黏稠，用稱量紙稱取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加蓋牛肉膏、稱量紙牛肉膏、稱量紙 、少量水加熱溶解、少量水加熱溶解 取紙取紙蛋白胨、蛋白胨、naclnacl瓊脂瓊脂 補(bǔ)水定容補(bǔ)水定容4.4.調(diào)調(diào)phph、分裝、封口：、分裝、封口：5.5.滅菌：滅菌：6.6.倒平板：倒平板：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿分散成單個(gè)細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞, ,形成單

10、個(gè)菌落形成單個(gè)菌落約約50防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染灼燒滅菌，灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 50 左右左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？基的溫度？ 答：答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶

11、的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。生物污染培養(yǎng)基。3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又既可以使培

12、養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用最好不要用這個(gè)平板這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。培養(yǎng)微生物。二二. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌：純化大腸桿菌：平板劃線法：平板劃線法：菌種菌種劃劃3 3個(gè)平板個(gè)平板1 1個(gè)不劃線個(gè)不劃線1.1.純化大腸桿菌的方法：純化大腸桿菌的方法：平板劃線法平板劃線法和稀釋涂布平板法和稀釋涂布平板法接種環(huán)接

13、種環(huán)防止劃破培養(yǎng)基防止劃破培養(yǎng)基（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（重復(fù)實(shí)驗(yàn)）（空白對(duì)照）（空白對(duì)照） 平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體。1 1、為什么在操作的第一步以及每次劃線之、為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

14、需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物可能存在的微生物污染培養(yǎng)物殺死殺死上次殘留的菌種上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時(shí)，保證使下一次劃線時(shí)，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。減少，以便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。環(huán)境和感染操作者。 2.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其在灼燒接

15、種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。的菌落。6 6支試管

16、，分別加入支試管，分別加入9ml9ml無菌水無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液梯度稀釋菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器浸浸稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法：a.a.梯度稀釋菌液梯度稀釋菌液：b.b.涂布平板涂布平板：不超過不超過0.1ml0.1ml各梯度分別涂布各梯度分別涂布3個(gè)平板個(gè)平板1 1個(gè)不涂布作空白對(duì)照個(gè)不涂布作空白對(duì)照滴滴灼灼涂涂稀稀釋釋10103 3倍倍稀稀釋釋10104 4倍倍稀稀釋釋10105 5倍倍 稀釋涂布法是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，稀釋涂布法是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將

17、不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步應(yīng)如何進(jìn)行無步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？菌操作？應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌無菌”。例如：酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、例如：酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、 吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管頭不要接觸任何其他物體、 吸管要在酒精燈火焰周圍等等。吸管要在酒精燈火焰周圍等等。3平板劃線法

18、和稀釋涂布平板法的比較平板劃線法和稀釋涂布平板法的比較優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍適用范圍平板劃線平板劃線分離法分離法可以觀察菌落特可以觀察菌落特征，對(duì)混合菌進(jìn)征，對(duì)混合菌進(jìn)行分離行分離不能計(jì)數(shù)不能計(jì)數(shù)適用于好氧菌適用于好氧菌稀釋涂布稀釋涂布平板法平板法可以計(jì)數(shù)，可以可以計(jì)數(shù)，可以觀察菌落特征觀察菌落特征吸收量較少、吸收量較少、較麻煩，平板較麻煩，平板不干燥效果不不干燥效果不好，容易蔓延好，容易蔓延適用于厭氧菌適用于厭氧菌和兼性厭氧菌和兼性厭氧菌平板劃線法：平板劃線法：二二. .大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)：制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基純化大腸桿菌：純化大腸桿菌：1

19、.1.接種：接種：稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法：2.2.培養(yǎng)：培養(yǎng)：將將接種后接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種未接種的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基放入放入3737恒溫箱中培養(yǎng)恒溫箱中培養(yǎng)12h12h24h24h后，后，觀察并記錄觀察并記錄稀稀釋釋10103 3倍倍稀稀釋釋10104 4倍倍稀稀釋釋10105 5倍倍（三）菌種的保藏：（三）菌種的保藏：1.1.臨時(shí)保藏：臨時(shí)保藏： 試管固體斜面培養(yǎng)基上，試管固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)長(zhǎng)成菌落培養(yǎng)長(zhǎng)成菌落44冰箱保存冰箱保存2.2.長(zhǎng)期保存：長(zhǎng)期保存：菌種易被污染、變異菌種易被污染、變異甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油（滅菌）甘油（滅菌）1ml1ml菌液菌液2020擱置斜擱置斜面面四、課題成果評(píng)價(jià)四、課題成果評(píng)價(jià) （一）培養(yǎng)基的制作是否合格（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1 12 d2 d后無后無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏