pro測定方法分為兩大類

1、蛋白質的測定方法分為兩大類：一類是利用蛋白質的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測定蛋白質含量，另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團和芳香基團測定蛋白質含量。但是食品種類很多，食品中蛋白質含量又不同， 特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此蛋白質的 測定通常利用經典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標準酸液吸收，用標準酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計算出蛋白質的含量。由于食品中蛋白質含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣 的。一 凱氏定氮法這種方法是1883年Kjeldahl發(fā)明，當時凱氏只使用 H2SO4來分解試樣，來定量谷物

2、中的蛋 白質，他只知用 H2SO4分解試樣，而不能闡明 H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應歷程， 所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長時間，后來由Gunning加入改進，他改進的辦法是在 消化時加入K2SO4使沸點上升，這樣加快分解速度，因為溫度由原來硫酸沸點的 380上升到 400C，提高了不到67C所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。我們在檢驗食品中蛋白質時，往往只限于測定總氮量， 然后乘以蛋白質核算等數(shù)，得到蛋白質含量，實際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質氮化合物，故稱 為粗蛋白質。1凱氏常量定氮法：不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的，

3、首先第一個步驟是消化：(1) 消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。并破壞有機物，使有機物中的C H氧化為C02和H2O蒸汽逸出，而蛋白質則分解氮，則與硫酸結合成硫酸銨，留在酸性 溶液中。(2) 在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應生成硫酸氫鉀，可提高反應溫度，一般純硫酸加熱沸點330C，而添加硫酸鉀后，溫度可達 400C，加速了整個反應過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫 酸的不斷地被分解， 水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而

4、造成損失。為了加速反應過程， 還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。所以有機物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應指示 劑。(1) 蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液 要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。(2) 吸收與滴定：蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸溶液進行氨的吸收，然后再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標準鹽酸直接滴定， 硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色

5、反應，它有吸收氨的作用。1操作步驟:準確稱取樣品中 0.50- 2.00gt于500ml凱氏瓶中宀加 10g無水K2S04加0.5gCuSO4加20ml H2SO4在通風櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后， 將瓶子搖動一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中t繼續(xù)消化30分鐘t至到樣液呈綠色狀態(tài)，停止消化，冷卻t加200ml水t連接蒸餾裝置t用硼酸作吸收液t在K氏瓶中加波動珠數(shù)粒和80ml50% NaOT立即接好定氮球t加熱t(yī)至到K氏瓶內殘液減少到三分之一時，取出用水沖洗t用0.1N HCl滴定。N ( V2-V1) 0.014W計算：總氮量 %=( N(V2- V1) X 0.01

6、4 ) /W X 1000.014-氮的毫克當量數(shù)蛋白質=總氮%XK乳制品 K=6.38 ( N=15.7%)小麥粉 K=5.79 ( N=17.6%)動物膠 K=5.6 (N=18.0%)冰蛋 K=6.7 (N=14.8%)大豆制品K=6.0 (16.7%)K=6.25 則(N=16%K-換稱等數(shù)各種試劑的作用：濃 H2SO4A :脫水使有機物炭化，然后有機物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2本身則變?yōu)?CO2B:氧化C:蛋白質與濃 H2SO4生成 NH3T, CO2 SO2, H2OTD: NH3與H2SO4生成硫酸銨(1) CuSO4的作用(催化劑)CuSO4為紅色沉淀，當C完全消化

7、后，反應停止，紅色消失，變?yōu)樘m色，即為消化達到完全，蘭色為CuSO4的顏色(2) K2SO4的作用(提高沸點)沸點由330C提高到400C加速了反應過程。(3 )硒粉和過氧化氫，氧化汞都為催化劑，但為了防止污染通常采用硫酸銅(4) 50%NaO的作用下面我就針對幾點來說明為何影響氨化完全和速度快的因素：(1) K氏燒瓶和取樣量如果稱1g以上的樣品，就需要 K氏燒瓶最小500ml, 8001000ml的更好，這樣的 K氏燒瓶 對于縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。(2) 分解劑AH2SO4和K2SO4的添加量有機無分解需要H2SO4量，H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同，如

8、果試樣含脂類 高，則加H2SO侈，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4勺添加比例是：1g 樣品K2SO4:H2SO4=7g： 12ml這種比例在國內外都使用，是公認的還有一種比例：K2SO4: H2SO4=10 20mlB 催化劑用作催化劑的有 Hg HgO Se,硒化合物，CuSO4 TiO2，對Hg, HgO有毒但結果好，Se與CuSO4得到結果是一種，TiO2，的結果偏低，采用不同的催化劑則消化時間不同，HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55, TiO2消化麥子70,所以在給出測定結果時要注明催 化劑的類型。(

9、3) 熱源的強度K2SO4加得多，如果熱源弱,消化時熱源的強度同迅速消化和完全氨化關系很大，即便鹽類也是沒有意義的，熱源過強導致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細和長短等，也與熱源的強度有關。（4 ）氨的蒸餾和吸收及滴定蒸餾有兩種：1 直接蒸餾（裝置簡便，準確性好）2 水蒸汽蒸餾蒸餾加NaOH是 50% 加的量為 H2SO4量的4倍，硫酸量為 12ml，貝U NaOH為12X 4=48ml,而且一般高于這個理論值，即加到5055ml，如果NaOH!加的不夠就變成 H2S H2S是強酸，使顏色變紅。吸收液有：1標準H2SO4用標準堿返滴定，甲醛紅指示劑2硼酸 用HCI

10、進行滴定，混合指示劑目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替 H2SO4這樣可省略了反滴定， H2SO4是強酸，要求較嚴， 而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3河上可將氨完全吸收，為保險期間一般用 4%6實驗注意事項a. 樣品應時均勻的，若是固體樣品應事先研細，液體樣要混合均勻。b. 樣品放入K氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。c. 消化時，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷后，加入 30%±氧化氫催化劑23ml,促使氧化。d. 在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免

11、附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。e. 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。f. 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色， 如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用 0.1%甲醛紅乙醇溶液。g. 氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。h. 向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀無。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡合物。i. 消化劑綠色后繼續(xù)消化 30分鐘即可。2

12、K氏微量定氮儀法3 K氏半微量定氮儀法（2 、3原理一樣）操作方法大同小異，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。N( V2-V1)0.014V10/100計算總氮%=(N(V2-V1) X 0.014)/(w X 10/100) X 100對于微量定氮儀法，儀器有了改進，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。4 K氏自動定氮法原理與上面一樣，儀器， 采用K氏自動定氮儀：其裝置內具有自動加堿蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數(shù)字顯示裝置，消化裝置：由優(yōu)質玻璃制成的 K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。二 水揚酸比色法：1 原理： 樣品中的蛋白質經 H2SO4消化轉化

13、為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。2 方法(1)標準曲線的繪制取6個25ml容量瓶編號0123456分別加空白酸液2ml分別加磷酸鹽緩沖液5ml稀釋至總體體積至 15ml分別加水揚酸鈉5ml37C水浴15分加入次氯酸鈉2.5ml37C水浴15分鐘取出試液于660nm下進行比色，繪標準曲線。(2) 樣品處理：準確稱樣0.201.00g t于K氏瓶中t加15mlH2SO4和5g催化劑宀電爐上加熱到沸騰后宀加大火力消化t直到出現(xiàn)暗綠色時t搖動瓶子tk氏瓶全部消化后t冷卻t加水至250ml容量瓶

14、。(3) 樣品測定：準確吸取上述消化溶液 10mli于100ml容量瓶中t定容t準確吸 2ml于25ml容量瓶中宀加5ml磷酸緩沖液t以下操作與標準曲線繪制的步驟相同并以試劑空白微對照，測得樣液的光密度，從標準曲線查出其含氮量。（4）計算CXF含氮 %= x 100W 1000X 1000C-從標準曲線中查出測定樣液的含氮量（Ug）F-樣品溶液的稀釋倍數(shù)W-樣品重量（g）蛋白質=總氮% K （ K可為6.25，也可查）3注意事項：A當天消化液最好當天測定，結果重現(xiàn)性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。B當在PH和試劑適當范圍內加入氯源后，顏色的顯色和溫度有關，應嚴格控制反應溫度。C這種方法測定

15、結果基本與 K氏法一致。4 試劑(1) 氯標液：稱經110C干燥2h的硫酸銨0.4719g宀于燒瓶中定容 10ml此液1ml相當于 I.Omg氮標液t使用時配制成1ml相當于2.50Ug氮標液。(2) 空白酸液：稱0.50g蔗糖t加15mlH2SO4和5g催化劑t與樣品一樣消化t定容250mT 使用時吸收此液10mlT加水至100ml為工作液備用。(3) 磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉t加 38g磷酸三鈉t加20g三九石酸鉀鈉t加 400ml 水溶解t過濾t另稱 35gNaOH溶于100ml水中t冷至室溫t緩緩地攪拌加入磷酸鹽溶液中t加 入水稀釋至1000ml備用。(4) 水揚酸鈉溶液：稱

16、 25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于 200ml水中過濾，加水 稀釋至 500ml(5) 次氯酸鈉溶液：吸 4ml安替富民液，用水稀釋至100ml5 儀器（1）分光光度計（2 ）恒溫水浴三 紫外分光光度法1原理：蛋白質及其降解產物的芳香環(huán)基，在紫外區(qū)內對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與蛋白質濃度（38mg/ml）成直線關系，因此，通過測定蛋白質溶液的吸光度， 并參照事先用K氏定氮法分析的標準樣品，從標準曲線查出蛋白質的含量。2 試劑：（1）0.1mol/l 檸檬酸水溶液。（2） 8mol/l脲（NH2 2C0的2NNaOH溶液。脲的2N氫氧化鈉液（3）95%乙醇

17、（4）無水乙醚3 儀器（1）751型的紫外分光光度計（2）離心機4 操作方法（1）標準曲線的繪制：準確稱取樣品200g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過濾于玻璃離心管中，以每秒鐘30005000轉的速度離心10分鐘，分別吸出上清夜 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個10ml容量瓶鐘，每個容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘（如果離心再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測定其吸光度。（做參比值）以事先用K氏定氮法測定的樣品中蛋白質的含量微橫坐標上面的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。（2

18、）樣品測定準確稱取試樣1.00g t于50ml燒杯中t加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml宀攪拌10分鐘宀四層 紗布過濾到離心管中t用 8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測吸光度，從標準 曲線上查出蛋白質的含量。計算：蛋白質=C/WX100C-從標準曲線上查得的蛋白質含量（mg）W-測定樣品溶液相當于樣品量（ mg說明：a. 此法運用于糕點，牛乳和可溶性蛋白質樣品，測定糕點時，應把表皮顏色去掉。b. 溫度對蛋白質水解有影響，操作溫度應控制在2030C。四 雙縮脲法-皮尼克法1原理：雙縮脲在堿性條件中，能與CuS04吉合成紅紫色的絡合物。蛋白質分子中含有肽鏈與雙縮脲結構相似，也呈此反應。本法直接用于測定像小麥粉等固體試樣的蛋白質含量。