發(fā)酵工程》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、微生物發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)王金華實(shí)驗(yàn)規(guī)則1、實(shí)驗(yàn)前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書。若經(jīng)提問發(fā)現(xiàn)沒有預(yù)習(xí)者，須在教師指定的時(shí)間內(nèi)預(yù)習(xí)完畢，方得參加實(shí)驗(yàn)。2、實(shí)驗(yàn)前須認(rèn)真檢查儀器、試劑、用具及實(shí)驗(yàn)材料。如有破損、短缺應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，經(jīng)同意后方可調(diào)換和補(bǔ)充。對(duì)玻璃器皿須做好清洗工作。3、實(shí)驗(yàn)過程中不得隨便挪動(dòng)外組的儀器、用具和實(shí)驗(yàn)材料。不得隨意撥動(dòng)儀器開關(guān)或電源開關(guān)，須按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行。4、實(shí)驗(yàn)材料、藥品的使用，應(yīng)在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下注意節(jié)約，杜絕浪費(fèi)。5、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持肅靜，不得談笑喧嘩，不許搞其他動(dòng)作，以免影響他人實(shí)驗(yàn)。6、清洗儀器、用具、材料時(shí)，須將固形物倒入指定容器內(nèi)，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞

2、。7、實(shí)驗(yàn)過程中，須按操作規(guī)程仔細(xì)操作，注意觀察試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)及時(shí)記錄。不得抄寫他人的實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)記錄，否則，須重做。如有疑問，應(yīng)向指導(dǎo)教師詢問清楚后方可進(jìn)行。8、實(shí)驗(yàn)完畢后，須將玻璃儀器、用具等清洗干凈，按原來的位置擺設(shè)放置。如有破損須報(bào)告指導(dǎo)教師，并填寫儀器損壞登記簿。9、在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過程中，不得隨意食用原料和加工品。10、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，由值日生負(fù)責(zé)打掃實(shí)驗(yàn)室，保持室內(nèi)整潔，注意關(guān)上水、電、窗、門。- 1 - / 16實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制及滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆詹煌愋臀⑸锱囵B(yǎng)基的配方及其制備方法。二、儀器設(shè)備及原材料高壓滅菌鍋，250ml三角瓶，紗布，牛皮紙，瓊脂，其他化學(xué)藥品三、常用培養(yǎng)基的

3、配方及制備1、細(xì)菌常用培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基 蛋白胨 1.0%酵母膏 0.5%NaCl 1.0%可溶性淀粉 0.5%瓊脂 2.0%pH 7.0 121.3滅菌20min。（2）MRS（乳酸菌分離） 牛肉膏0.5%酵母膏0.5%蛋白胨1%葡萄糖1%乳糖0.5%NaCl 0.5% 瓊脂2% pH6.8 固體培養(yǎng)基加瓊脂2%；半固體培養(yǎng)基加瓊脂0.75%2、酵母菌常用培養(yǎng)基（1）麥芽糖培養(yǎng)基 蛋白胨1%麥芽糖2% 酵母膏0.5%瓊脂2%自然pH 121.3滅菌20min。 3、霉菌常用培養(yǎng)基PDA（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基） 去皮馬鈴薯200g切成小塊，加水1000ml煮沸30min出汁，三層紗布過濾，濾液

4、中加入2%蔗糖，補(bǔ)充水至終體積1000ml，加瓊脂2%，自然pH。121.3滅菌20min。四、實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題及討論 1、配制培養(yǎng)基操作過程中的問題。 2、培養(yǎng)基滅菌操作過程中的問題。 3、培養(yǎng)基滅菌后出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象，分析原因，討論解決方法。實(shí)驗(yàn)二 酸奶的釀制及乳酸菌的分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、學(xué)習(xí)并掌握酸奶制作的基本原理和方法。2、學(xué)習(xí)并掌握從酸奶中分離和純化乳酸菌的方法。二、基本原理酸奶是以牛乳為主要原料，接入一定量乳酸菌，經(jīng)發(fā)酵后制成的一種具有較高營養(yǎng)價(jià)值和特殊風(fēng)味的發(fā)酵乳制品飲料。通過乳酸菌發(fā)酵牛奶中的乳糖產(chǎn)生乳酸，當(dāng)產(chǎn)酸到一定程度時(shí)，乳酸使牛奶中酪蛋白(約占全乳的29，占乳蛋白的85

5、)變性凝固而使整個(gè)奶液呈凝乳狀態(tài)。同時(shí)，通過發(fā)酵還可形成酸奶特有的香味和風(fēng)味(與形成乙醛、丁二酮等有關(guān))- 3 - / 16，并具有清新爽口的味覺。由于酸奶中含有乳酸菌的菌體及代謝產(chǎn)物，因而對(duì)腸道內(nèi)的致病菌有一定的抑制作用；對(duì)人體的腸胃消化道疾病也有良好的治療效果。三、器材1、乳酸菌種：自市售各種酸奶中分離 保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Strep tococcus thermophilus) 2、培養(yǎng)基：（1）發(fā)酵培養(yǎng)基：市售鮮奶或用奶粉進(jìn)行配制（2）分離乳酸菌培養(yǎng)基：（任選一種）培養(yǎng)基平板劃線MRS分離培養(yǎng)基3、優(yōu)質(zhì)全脂奶粉（內(nèi)含脂肪28%

6、，蛋白質(zhì)27%，乳糖37%，礦物質(zhì)6%，水分2%），白砂糖，蒸餾水。4、酸奶發(fā)酵瓶，封口膜，保鮮膜，不銹鋼鍋，鐵勺，塑料漏斗，無菌移液管（帶棉花），脫脂棉，牙簽，培養(yǎng)皿，恒溫水浴鍋，培養(yǎng)箱，冰箱等、溫度計(jì)四、操作步驟全脂乳粉、砂糖、水 混合均勻 預(yù)熱(60-70) 均質(zhì)(15-18MPa) 滅菌(85-90，5-8min) 冷卻(43-45) 接種 分裝 封口 菌種 活化 母發(fā)酵劑 生產(chǎn)發(fā)酵劑保溫發(fā)酵(42-43，3-6h) 酸奶瓶 清洗 開水燙洗消毒 冷藏(25) 成 品1、酸奶的制作調(diào)配與均質(zhì) 按1:7（14.3g:100ml）的比例加水（水質(zhì)要求： PH6.57.3，硬度10度（德國度）

7、，在4550下把奶粉配制成復(fù)原牛奶，并加入10%白砂糖及適量（0.4-3.0%）穩(wěn)定劑變性淀粉（使制成的酸奶口感飽滿，粘度高，抗機(jī)械剪切力強(qiáng)，使酸乳在輸送過程中保持良好狀態(tài)），高速混料，水合45 60min，防止氣泡產(chǎn)生。或用市售鮮牛奶加5%蔗糖調(diào)勻也可。裝瓶 在250ml的酸奶發(fā)酵瓶中裝入牛奶200ml，裝瓶量80%。滅菌 將裝有牛奶的發(fā)酵瓶置于80恒溫水浴鍋中用巴氏滅菌法10磅滅菌15min，或于90水浴中滅菌5min。冷卻 將已滅菌的牛奶冷卻到40-45。接種 用無菌移液管以5-8%的接種量將市售酸奶接種入冷卻至40-45的牛奶中，并充分搖勻。培養(yǎng) 把接種后的發(fā)酵瓶置于40-42溫箱中培

8、養(yǎng)4-12h。當(dāng)乳酸酸度升高到0.8%，pH降低到4.2-4.4時(shí)，凝乳完全形成并有少量乳清析出，表面有小顆粒（視情況而定，培養(yǎng)過程中切勿搖動(dòng)，以防乳塊散掉，不易重結(jié)）。冷藏后熟 酸奶在發(fā)酵形成凝塊后，取出置1-7的低溫下冷藏12-24h，后熟，以獲得酸奶的特有風(fēng)味和口感。- 3 - / 16品味 品嘗自己制作的酸奶，判斷其感官品質(zhì)是否達(dá)到要求，若達(dá)不到要求，分析其原因。酸奶質(zhì)量的評(píng)定以品嘗為標(biāo)準(zhǔn)，通常有色澤、凝塊狀態(tài)，表層光潔度、酸度及香味、無異味等各項(xiàng)指標(biāo)。感官檢驗(yàn)試驗(yàn)方法 色澤和組織狀態(tài)：取適量試樣于50mL燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)。 滋味和氣味：取適量試樣于50mL燒杯中，

9、先聞氣味，然后用溫開水漱口，再品嘗樣品的滋味。品嘗時(shí)發(fā)現(xiàn)有異味則可判定污染了雜菌。貯存 產(chǎn)品的貯存溫度為26。2、酸奶中乳酸菌的分離純化倒平板培養(yǎng)基：將分離用培養(yǎng)基完全融化并冷卻到45左右倒平板，冷凝空白培養(yǎng)后備用。稀釋：將待分離的酸奶進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取一定稀釋度的菌液做平板分離。分離純化：乳酸菌的分離可采用新鮮酸奶進(jìn)行平板涂布分離，或直接用接種環(huán)蘸取酸奶作劃線分離。分離后，置于37下培養(yǎng)以獲得單菌落。觀察菌落特征：經(jīng)2-3d培養(yǎng)，待菌落長成后，仔細(xì)觀察并區(qū)別不同類型的乳酸菌。酸奶中的各種乳酸菌在馬鈴薯汁牛奶培養(yǎng)基平板表面通常呈現(xiàn)三種形態(tài)特征的菌落：扁平型菌落：大小為2-3mm，邊緣不整齊，很薄

10、，近似透明狀，染色鏡檢為細(xì)桿菌；半球狀隆起菌落：大小為1-2mm，隆起成半球狀，高約0.5mm，邊緣整齊且四周可見酪蛋白水解透明圈，染色鏡檢為鏈球狀；禮帽形突起菌落：大小為1-2mm，邊緣基本整齊，菌落中央呈隆起狀，四周較薄，有酪蛋白透明圈，染色鏡檢呈鏈球狀。單菌株發(fā)酵試驗(yàn)：若將上述單菌落接入牛奶，經(jīng)活化增殖后再以10%的接種量接入消毒后的牛奶中，分別于37和45下培養(yǎng)，各菌株的發(fā)酵液均可達(dá)到108個(gè)細(xì)胞/ml。若采用兩種菌株混合培養(yǎng)，則含菌量常可倍增。品嘗：單株發(fā)酵成的酸奶與混菌發(fā)酵成的酸奶相比較，其香味和口感都比較差。兩菌混合發(fā)酵又以球菌和桿菌等量混合接種所發(fā)酵成的酸奶為佳。 桿菌產(chǎn)酶分解

11、蛋白質(zhì)氨基酸球菌產(chǎn)酸蛋白質(zhì)變性凝結(jié)成塊醇酯化香味在制備酸奶時(shí)，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合物在4050乳中發(fā)酵23h即可達(dá)到所需的凝乳狀態(tài)與酸度，而任何單一菌株的發(fā)酵時(shí)間都在10h以上，其原因就是因?yàn)楸＜永麃喨闂U菌與嗜熱鏈球菌之間存在互生現(xiàn)象。保加利亞乳桿菌在發(fā)酵的初期分解酪蛋白而形成氨基酸和多肽，促進(jìn)了嗜熱鏈球菌的生長，隨著嗜熱鏈球菌的增加，酸度增加，抑制了嗜熱鏈球菌的生長。嗜熱鏈球菌生長過程中，乳脲活動(dòng)產(chǎn)生CO2、甲酸刺激保加利亞乳桿菌生長。發(fā)酵的初期嗜熱鏈球菌生長的快；發(fā)酵1小時(shí)后與保加利亞乳桿菌的比例為(3-4):1。3、感官特性    &#

12、160;  應(yīng)符合表1的規(guī)定。 表1項(xiàng)  目純酸牛乳調(diào)味酸牛乳、果料乳牛乳色澤呈均勻一致的乳白色或微黃色呈均勻一致的乳白色，或調(diào)味乳、果料應(yīng)有的色澤- 4 - / 16滋味和氣味具有酸牛乳固有的滋味和氣味具有調(diào)味酸牛乳或果料酸牛乳應(yīng)有的滋味和氣味組織狀態(tài)組織細(xì)膩、均勻，允許有少量浮清析出；果料酸牛乳有果塊或果粒4、衛(wèi)生指標(biāo)       應(yīng)符合表2的規(guī)定。 表2項(xiàng)  目純酸牛乳調(diào)味酸牛乳果料酸牛乳苯甲酸，g/kg        

13、                 0.030.23山梨酸，g/kg                         不得檢出0.23硝酸鹽（以NaNO3計(jì)），mg /kg  

14、60;      11.0亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)），mg/kg        0.2黃曲霉毒素M1， g /kg                0.5大腸菌群，MPN/100Ml            

15、60;   90致病菌（指腸道致病菌和致病性球菌）不得檢出五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、將各批混菌發(fā)酵的酸奶品評(píng)結(jié)果記錄于下表中。批次品 評(píng) 項(xiàng) 目凝乳情況乳清淅出狀態(tài)稀薄粘度表面氣泡沫表面光澤口感酸度香味異味發(fā)粘pH結(jié)論12342、將單菌和混菌發(fā)酵的酸奶品評(píng)結(jié)果記錄于下表中。單菌及混菌比例品 評(píng) 項(xiàng) 目pH結(jié)論凝乳情況口感香味異味桿 菌球 菌桿菌:球菌（1:1）桿菌:球菌（1:4）3、在制備酸奶時(shí)，為何混菌發(fā)酵比單一菌株發(fā)酵更優(yōu)越？4、雙岐桿菌的乳酸發(fā)酵途徑與明串珠菌的乳酸發(fā)酵途徑有什么不同? - 5 - / 16實(shí)驗(yàn)三 甜酒釀的制作和酒藥中糖化菌的分離一、目的要求1、學(xué)習(xí)并掌握甜酒釀

16、的釀制方法，了解釀酒的基本原理。2、進(jìn)一步了解淀粉在糖化菌根霉、毛霉和酵母菌作用下制成甜酒釀的過程。3、進(jìn)一步掌握微生物的分離、培養(yǎng)等基本方法和無菌操作技術(shù)。4、加深理解根霉或毛霉的形成特征。二、基本原理甜酒釀是將糯米經(jīng)過蒸煮糊化，接種后，在適宜的條件下（28-30），讓種曲中的霉菌孢子萌發(fā)菌絲體，大量繁殖后通過酒藥（根霉、毛霉和酵母菌等微生物的混合糖化發(fā)酵劑）中的根霉和毛霉等微生物所產(chǎn)淀粉酶的作用將原料中糊化后的淀粉糖化，將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，然后酒藥中的酵母菌利用糖化產(chǎn)物生長繁殖，并通過酵解途徑將糖轉(zhuǎn)化成酒精，從而賦予甜酒釀特有的香氣、風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)。隨著發(fā)酵時(shí)間延長，甜酒釀中的糖分逐漸

17、轉(zhuǎn)化成酒精，因而糖度下降酒度提高，故適時(shí)結(jié)束發(fā)酵是保持甜酒釀口味的關(guān)鍵。要初步學(xué)會(huì)和掌握釀制方法并不困難，從微生物學(xué)的觀點(diǎn)來看，釀制的關(guān)鍵在于：要有優(yōu)質(zhì)的酒釀種曲，即種曲中應(yīng)含有糖化率高的優(yōu)質(zhì)根霉、毛霉孢子或菌絲體；應(yīng)選擇優(yōu)質(zhì)的糯米作原料；嚴(yán)格無菌操作規(guī)程，盡量避免雜菌污染；合理控制釀制條件等。 以糯米(或大米)經(jīng)甜酒藥發(fā)酵制成的甜酒釀，是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。我國釀酒工業(yè)中的小曲酒和黃酒生產(chǎn)中的淋飯酒在某種程度上就是由甜酒釀發(fā)展而來的。三、實(shí)驗(yàn)材料酒藥（根曲霉AS3.866）、糯米，馬鈴薯，蔗糖甜酒藥中糖化菌的分離培養(yǎng)基：馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基蒸鍋，紗布，1000ml燒杯，250ml廣口培養(yǎng)

18、瓶，封口膜，保鮮膜，牛皮紙，天平，培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋、淘米盆、防水紙、繩子、涼開水，顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、解剖針、酒精燈、鑷子、培養(yǎng)皿等。四、操作步驟（一）甜酒釀的制作 酒 藥 洗米 蒸飯 淋水 降溫 落缸搭窩 發(fā)酵 甜酒釀1、浸米與洗米：選擇優(yōu)質(zhì)新鮮糯米，淘洗干凈后浸泡過夜，使米粒中的淀粉粒子吸水膨脹，便于蒸煮糊化，清水沖洗至水清亮，撈起瀝干。 2、隔水蒸煮：將糯米放在蒸鍋內(nèi)擱架的紗布上隔水蒸煮，15磅10-20min，常壓30min，至米飯熟透為止。要求達(dá)到熟而不糊，外硬內(nèi)軟，內(nèi)無夾心，疏松易散，透而不爛，均勻一致。3、淋水降溫：用清潔冷水淋洗蒸熟的糯米飯，使其降溫至35左右，同

19、時(shí)使飯粒松散。4、接入種曲釀制：將冷卻到35左右的米飯，按干糯米重量換算接種量，將0.4%的經(jīng)粉碎的根霉曲與米飯拌勻，盛于廣口培養(yǎng)瓶中，飯粒搭成中心下陷的喇叭形凹窩，以利于出汁，飯面均勻撒上少許曲粉，用封口膜及牛皮紙覆蓋于廣口培養(yǎng)瓶表面，用線包扎后置于30溫箱保溫培養(yǎng)48h即可食用。釀成的甜酒釀應(yīng)是醪液清澈半透明而甜醇爽口。5、品嘗（二）甜酒藥中糖化菌的分離- 6 - / 16無菌操作技術(shù)，以平板劃線法分離甜酒藥中的糖化菌1. 每組取無菌培養(yǎng)皿兩付，先在培養(yǎng)皿中加入兩滴5000U/mL的鏈霉素液，而后用已融化的馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基倒平板，使鏈霉素與培養(yǎng)基充分混勻，制成平板。2. 取已被碾碎

20、的甜酒藥粉1環(huán)在平板上劃線，然后倒置于2830恒溫箱中培養(yǎng)46d。3. 觀察平板上的菌落形態(tài)，用接種環(huán)調(diào)取霉菌菌落的孢子或菌絲體于新鮮的馬鈴薯-蔗糖-瓊脂平板上，再進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)，即平板上只有一種霉菌的菌落或菌苔。對(duì)已分離出的糖化菌進(jìn)行個(gè)體形態(tài)的觀察1.打開皿底用低倍鏡直接觀察分離菌各部分結(jié)構(gòu)形態(tài)，如孢囊梗、孢囊、囊軸、假根、匍匐菌絲。 2.取一干凈的載玻片，滴一滴乳酚油，然后用解剖針挑取少量帶有孢囊的分離菌菌絲放在懸滴液中，將菌絲分散平鋪，然后蓋上蓋玻片，輕輕一壓，注意應(yīng)避免氣泡產(chǎn)生。3.鏡檢：先用低倍鏡觀察菌絲有無隔膜，孢囊梗的形態(tài)，孢囊的著生方式，孢囊和囊軸的形態(tài)和大小。然

21、后換成中倍鏡觀察，繪制分離菌的形態(tài)圖，注明各部位名稱。并根據(jù)菌落和菌體形態(tài)特征，判斷出該分離菌是何種真菌。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)發(fā)酵期間每天觀察、記錄發(fā)酵現(xiàn)象。(2)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定，將各批發(fā)酵的甜酒釀品評(píng)結(jié)果記錄于下表中。寫出品嘗體會(huì)。批 次品 評(píng) 項(xiàng) 目結(jié)論出汁（ml）口感酒度甜味異味pH12342、甜酒釀制作中有哪幾類微生物參與發(fā)酵作用？各自起何種作用？3、成功制作甜酒釀的關(guān)鍵步驟是什么？實(shí)驗(yàn)四 檸檬酸產(chǎn)生菌的分離及檸檬酸的固體發(fā)酵一、目的要求1、學(xué)習(xí)從環(huán)境中選出能產(chǎn)檸檬酸的霉菌，了解從環(huán)境中獲得目的菌種的一般方法；2、掌握檸檬酸的發(fā)酵、提取、檢測(cè)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理檸檬酸發(fā)酵

22、是利用微生物在一定條件下的生命代謝活動(dòng)而獲得產(chǎn)品的。不論采用何種菌株，檸檬酸發(fā)酵都是典型的好氧發(fā)酵。工業(yè)上的好氧發(fā)酵發(fā)基本上有三種，即表面發(fā)酵、固體發(fā)酵和深層發(fā)酵。前兩種方法利用空氣氣相中的氧氣，后者則是利用液體中的溶解氧。至今在檸檬酸發(fā)酵工業(yè)中，上述三種發(fā)酵工藝均并存。雖然液體深層發(fā)酵法已大量代替了固體發(fā)酵法，但處于一些廢渣的利用及投資較少的緣故，在一些地方淺層固體法生產(chǎn)檸檬酸仍在使用中。適合于固體發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的原料諸如：甘薯渣、木薯渣、蘋果渣和甘蔗渣等。- 8 - / 16檸檬酸的固體發(fā)酵工藝分為淺層法和厚層法，均是將發(fā)酵原料、輔料及菌體放在疏松的固體支持物上，經(jīng)過微生物的代謝活動(dòng)，將

23、原料中的可發(fā)酵成分轉(zhuǎn)化為檸檬酸的過程。1、黑曲霉發(fā)酵糖類生成檸檬酸的能力很強(qiáng)，其主要特征是耐酸性極強(qiáng)，在pH為1.6的情況下，仍能良好生長。利用這一特點(diǎn)，采用pH為1.6的酸性營養(yǎng)濾紙即可分離該菌種；2、發(fā)酵產(chǎn)物中檸檬酸為多鹽有機(jī)酸，能與CaCO3形成沉淀，利用鈣鹽法即可檢測(cè)。三、實(shí)驗(yàn)材料及用品1、樣品：霉?fàn)€的桔皮2、菌種：黑曲霉（Aspergillus . niger）IFFI 23153、培養(yǎng)基和試劑：（1） 酸性蔗糖培養(yǎng)基 蔗糖15% NH4NO30.2% KH2PO40.1% MgSO47H2O 0.25% 用鹽酸調(diào)pH2.0 121滅菌20min（2）固體發(fā)酵培養(yǎng)基 米糠:麩皮=2:

24、1，65%水分（45ml:50g），121滅菌30min（3）0.1M NaOH溶液，1M鹽酸 （4）0.5%酚酞指示劑：0.5g酚酞，溶于100ml 95%乙醇中4、器皿：白瓷托盤，保鮮膜，切刀，菜板，培養(yǎng)皿（帶濾紙），250ml三角瓶，搖床，恒溫培養(yǎng)箱，滅菌鍋，酸堿滴定管，紗布，牛皮紙四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）深層液體發(fā)酵1、菌種分離：取霉?fàn)€桔皮（0.04cm2）放入10ml三角瓶中，振蕩35min，然后用水稀釋510倍；2、菌種純化：取稀釋液0.51ml放入酸性培養(yǎng)基上（稀釋液：培養(yǎng)基=1：10），搖勻，傾倒在平皿中的濾紙上，25培養(yǎng)23d即有菌落產(chǎn)生；3、發(fā)酵：將培養(yǎng)出的霉菌接種入液體酸性蔗糖

25、發(fā)酵培養(yǎng)基中（25ml/250ml三角瓶），30搖床培養(yǎng)23d，過濾收集發(fā)酵液。（二）淺層固體發(fā)酵1、培養(yǎng)基制備：將米糠：麩皮按照2：1的比例配料，加65%的水分（45ml:50g），拌勻后按15g/250ml分裝到三角瓶中，用紗布牛皮紙封扎瓶口，于121，滅菌30min。2、接種：將培養(yǎng)基趁熱打散，待降溫到37，即可將黑曲霉孢子接種到其中，振蕩混勻。3、發(fā)酵：培養(yǎng)溫度30-32，經(jīng)24h培養(yǎng)后搖瓶一次，測(cè)pH；將三角瓶放平后繼續(xù)培養(yǎng)24h左右使培養(yǎng)基結(jié)成塊狀。此時(shí)應(yīng)扣瓶使之充分通氣并散熱，測(cè)pH；再培養(yǎng)72h使瓶內(nèi)長滿豐盛的孢子即可出料，測(cè)pH。4、產(chǎn)物檢測(cè)：（1）檸檬酸鑒定 取5ml發(fā)酵液

26、于試管中，滴入飽和CaCO3溶液，有白色沉淀則證明產(chǎn)生檸檬酸。（2）產(chǎn)酸量測(cè)定 取10ml發(fā)酵液（10g醅樣，加蒸餾水100ml浸泡15min后過濾得濾液），滴加0.5%酚酞指示劑2滴，用0.1M標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至淡粉紅色，計(jì)算產(chǎn)酸量（標(biāo)準(zhǔn)滴定法）。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、將發(fā)酵全過程測(cè)定酸度的pH值繪制成曲線圖。- 8 - / 162、計(jì)算出實(shí)際實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液的產(chǎn)酸量。3、檸檬酸固體發(fā)酵過程中應(yīng)注意哪些操作要點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)五 酒精發(fā)酵及下游處理實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆站凭l(fā)酵工藝的具體操作。二、實(shí)驗(yàn)原理EMP途徑 脫 羧 還 原己糖 丙酮酸 乙醛 乙醇（酒精）三、材料：玉米粉，糯米，高粱粉，釀酒酵母(Sacc

27、haromyces cerevisiae)器材：燒杯，玻璃棒，天平，電爐，鋼鍋，5L三角瓶，恒溫箱，彈孔膠塞，發(fā)酵栓，蒸餾裝置，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，冰箱四、工藝流程原料 液化、糖化處理 制醪 發(fā)酵 過濾 濾液（測(cè)酒度）五、實(shí)驗(yàn)步驟1、稱取原材料各1kg，將其進(jìn)行液化和糖化處理，液化的目的是使淀粉水溶性增大，糖化的目的是將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，有利于酵母的發(fā)酵；將液化和糖化的原料分裝入2000ml的三角瓶中，裝罐系數(shù)為40-80%；測(cè)定糖度。2、按照1.01.2%的比例稱取活性干酵母，將其倒入燒杯中，加入適量的水、葡萄糖、NaCl，放于30恒溫箱中保溫20min，進(jìn)行干性酵母活化。待酵母活化后，按10%將其

28、接種到裝有原料的三角瓶中。3、將接種的三角瓶置于28的恒溫箱中進(jìn)行發(fā)酵48h，用單孔膠塞接一橡皮管，末端接發(fā)酵栓（或倒扣一個(gè)漏斗），置于裝水的燒杯中，排氣。4、發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液pH、糖度。將發(fā)酵液微熱到40左右，降低發(fā)酵液的黏度，將其用紗布過濾，得濾液。5、測(cè)濾液酒度，計(jì)算100g原料出酒率。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 思考題1、在發(fā)酵過程中如何控制酵母菌生長的最適溫度？2、原料破碎徹底與否與提高酒精得率有何關(guān)系？3、計(jì)算100g原料出酒率。實(shí)驗(yàn)六、釀酒葡萄成熟度的控制以及入罐發(fā)酵一、目的與要求 成熟度是決定葡萄酒質(zhì)量的重要因素。通過測(cè)定漿果的成熟度，來了解原料的成熟質(zhì)量，確定各品種的最佳工藝成熟度，

29、并以此決定葡萄酒類型和相應(yīng)的工藝條件。同時(shí)簡單了解葡萄酒釀制的工藝原理。二、試劑與儀器- 9 - / 161.pH計(jì)、手持糖量計(jì)、托盤天平、量筒、水浴鍋、電爐、移液管、錐形瓶、容量瓶、5L玻璃瓶。干紅葡萄酒的發(fā)酵工藝過程圖2.斐林試劑A、B液，1%次甲基蘭，0.1mol/L氫氧化鈉溶液、1%酚酞指示劑、鄰苯二甲酸氫鉀，95%酒精，鹽酸等。三、方法與步驟1.采樣：從轉(zhuǎn)色期開始每隔5-7天采樣一次，對(duì)于大面積園，采用250株取樣法：每株隨機(jī)取1-2粒果實(shí)，并取300400粒；面積較小的品種?？呻S機(jī)取5 - l0穗果實(shí)，裝入塑料袋于冰壺中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室分析。簡單的成熟度的測(cè)定可用手持糖量計(jì)測(cè)定，如

30、果是精確的測(cè)定可在實(shí)驗(yàn)室中采用斐林試劑測(cè)定。2.百粒重與百粒體積，隨機(jī)取100粒果實(shí)，稱重，然后將其放入250ml(或500ml)量筒中，加入一定體積的水，至完全淹沒果實(shí)讀取量筒水面的讀數(shù)，減去加入時(shí)的水量，即為百粒體積。 3.出汁率的測(cè)定；取100g分選較好的葡萄果粒，用紗布擠汁，放入小燒杯中，立即稱量；出汁率=葡萄汁重量/葡萄果實(shí)重量。計(jì)算：在發(fā)酵結(jié)束后還需要再進(jìn)行出汁率的測(cè)定。 自流汁率()=W1/W2 x 100 總出汁率()=(W1+W2)/ Ws x 100式中W1葡萄漿自流汁的重量，(g)； Ws試樣重量，(g)； W2經(jīng)壓榨流出的葡萄汁重量，(g)。4.可溶性固形物與pH值；用

31、手持糖量計(jì)測(cè)定葡萄汁的可溶性固形物()，取20ml汁測(cè)pH值。5.還原糖與總酸：用斐林試劑法測(cè)定還原糖，用堿滴定法測(cè)定總酸。6.果皮色價(jià)測(cè)定：取20粒果實(shí)，洗凈擦干，撕下果皮并用吸水紙擦凈皮上所帶果肉及果汁，然后剪碎，稱取0.2克果皮用鹽酸乙醇溶液(1 mol/L鹽酸 : 95乙醇 = 15：85)50ml浸泡，浸泡20小時(shí)左右，然后測(cè)定540nm下的吸光度，計(jì)算果皮色價(jià)(XA x 10)/W (XA吸光度，W果皮重量g)。7.入罐：分選葡萄果實(shí)，剔除病蟲、生青、腐爛的果實(shí)。除梗，破碎30%，入罐。四、結(jié)果及分析- 10 - / 16評(píng)價(jià)漿果的成熟質(zhì)量。 實(shí)驗(yàn)七、干紅葡萄酒發(fā)酵的監(jiān)控一、實(shí)驗(yàn)的

32、目的掌握干紅葡萄酒釀造中發(fā)酵的監(jiān)控方法及相關(guān)的操作要求。二、所需儀器及試劑：1. 儀器： 5升、10升玻璃瓶，塑料盆，紗布、溫度計(jì)、比重計(jì)、天平、木棍、燒杯、量筒等。2. 試劑：亞硫酸（6%）、白砂糖、酵母、KHCO3。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1. 酵母、果膠酶的活化：采用工業(yè)專用酵母，按照200mg/L的量稱取酵母，放入三角瓶中，加入50mL蒸餾水，在40條件下活化20分鐘。按照20mg/L稱取果膠酶，在40左右活化10分鐘。2. 裝瓶：裝量不超過瓶容的75，同時(shí)按汁量加入5080mg/LS02攪勻，亞硫酸的濃度為6%，6%亞硫酸溶液的密度是1.03g/ml，添加量的計(jì)算（0.8ml/kg果實(shí)）：葡萄果

33、實(shí)kg×50/0.06×1000×1.03ml。并加入果膠酶20mg/L(或按說明書)同時(shí)取汁測(cè)糖、酸、比重、溫度。（注：添加的酵母、果膠酶以及亞硫酸的量都是以葡萄汁的量來計(jì)算）。3.浸漬發(fā)酵：每天測(cè)兩次比重、溫度，并定期用木柄壓“帽”、用冷水噴淋或在空調(diào)室內(nèi)控溫至2630。5當(dāng)比重降至10101020時(shí)，出酒，同時(shí)壓榨皮渣，混合、控溫1820，進(jìn)行后發(fā)酵管理。6. 當(dāng)相對(duì)密度降到0.993 - 0.998時(shí)（殘?zhí)?lt;2g/L時(shí)），酒精發(fā)酵結(jié)束，用KHCO3調(diào)整PH3. 2，觸發(fā)蘋果酸-乳酸發(fā)酵。7. 貯藏：滿瓶、調(diào)游離S02為2030mg/L。8. 下膠與過

34、濾，自然澄清半年后，用明膠下膠，通過下膠實(shí)驗(yàn)確定用量(5-20g/hL)，然后用澄清板過濾。9. 穩(wěn)定性試驗(yàn)：檢查酒的氧化、鐵、銅、色素、微生物穩(wěn)定性，若需要應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的處理。10. 裝瓶：將酒冷至其冰點(diǎn)以上0.5左右，在同溫條件下進(jìn)行澄清、除菌過濾。并加入5-10 g/L SO2，打塞、臥放貯存。四、思考與練習(xí) 如何確定紅葡萄酒的皮渣分離時(shí)間？試驗(yàn)八、葡萄酒發(fā)酵結(jié)束的理化指標(biāo)的測(cè)定一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馊绾未_定葡萄酒酒精發(fā)酵的結(jié)束，同時(shí)對(duì)葡萄酒進(jìn)行分離和封裝，轉(zhuǎn)入后發(fā)酵階段。熟悉各個(gè)理化指標(biāo)的測(cè)定方法。二、所需要的儀器和試劑：1. 電爐，蒸餾裝置，膠帶，酒精計(jì)(0-40%)(V/V) 2. 費(fèi)林試劑，0.1N氫氧化鈉，酚酞指示劑（1%），次甲基藍(lán)指示劑，量筒，葡萄糖5g/L。三、實(shí)驗(yàn)步驟：1.還原糖的測(cè)定- 11 - / 162.總酸的測(cè)定3.揮發(fā)酸的測(cè)定：揮發(fā)酸小于1g/L。4.酒度的測(cè)定：量取50mL酒樣，移入圓底燒瓶中，加入100mL蒸餾水，連接酒精蒸餾裝置，加熱蒸餾，直到蒸出的液體大