引物設(shè)計(jì)常見(jiàn)問(wèn)題

1、引物設(shè)計(jì)常見(jiàn)問(wèn)題與解答(二)17. 長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%,產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長(zhǎng)，突變的頻率累加起來(lái)就越高。研究人員總希望合成的引物萬(wàn)無(wú)一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能絕對(duì)保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過(guò)程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長(zhǎng)鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。18. 如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？答：對(duì)您遇到的困惑，我們表示同情。遇到

2、這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，我們?cè)陔娔X中保留所有原始數(shù)據(jù)。如果確認(rèn)引物合成序列沒(méi)有輸錯(cuò)，我們建議重新挑取克隆測(cè)序，您可能會(huì)找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測(cè)1-2個(gè)克隆就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測(cè)一些了。一般情況下，每個(gè)克隆突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費(fèi)重合一次，不過(guò)重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問(wèn)題的幾率?；蚱唇舆^(guò)程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一

3、下引物。19. 如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物突變，是否有補(bǔ)償？答：沒(méi)有。我們可以免費(fèi)重合一次，沒(méi)有其他任何補(bǔ)償或賠償，不承擔(dān)其他連帶責(zé)任。原因我們?cè)谇懊嬉烟岬?，化學(xué)合成效率不可能達(dá)到100%.您選擇了化學(xué)合成引物，合成過(guò)程中一些副產(chǎn)品所帶來(lái)的后果就可能不可避免的遇到。20. 引物是經(jīng)過(guò)PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個(gè)堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時(shí)的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時(shí)，很難說(shuō)不割到差別僅幾個(gè)堿基的引物。國(guó)內(nèi)有一個(gè)不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長(zhǎng)引物要的量都比較

4、高，導(dǎo)致割的條帶有時(shí)可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問(wèn)題可能就會(huì)少一些。21. 為什么OPC或PAGE純化的引物，再用HPLC鑒定純度不高？答： 有些用戶引物需要純度特別高的引物，在使用前會(huì)將HPLC鑒定引物的純度，常常發(fā)現(xiàn)引物的純度一般在70%左右。問(wèn)題來(lái)了，還有那30%是什么？ 引物純化PAGE, 需要電泳，用緩沖液將引物浸泡出來(lái)，然后用C18濃縮，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物質(zhì)基本引物了，除此以外，還有其他一些非核酸類物質(zhì)，他們一般不會(huì)干擾引物的使用。OPC純化也類似的情況。即使是HPLC純化的引物，如果對(duì)成品進(jìn)行分析，一般也難達(dá)到很高的純度，引物您得到的純品都是由制備柱過(guò)來(lái)

5、，洗脫峰經(jīng)過(guò)濃縮抽干，部分非核酸物質(zhì)被富集。22. 為什么修飾引物的產(chǎn)量要比一般引物低，價(jià)格要高？答：主要因?yàn)槭切揎梿误w穩(wěn)定性較差，偶連時(shí)間長(zhǎng)，效率低，最后得到的產(chǎn)量自然低于一般的引物。修飾引物通常需要PAGE或HPLC純化，純化過(guò)程損失大。修飾引物使用的原料是一般引物原料的幾百倍，所以產(chǎn)品的價(jià)格自然高23. TaqMan 探針設(shè)計(jì)的基本原則是什么？答：下列原則供您參考。TaqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。長(zhǎng)度一般為18-40mer .G-C含量控制在40-80%左右。避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。在引物的5端避免

6、使用G.選用比較多的堿基C.退火溫度Tm控制在 68-70C左右。有用的熒光染料參數(shù)NameName吸收波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)colors6-FAM6-carboxy-fluorescein494nm518nmGreenTET5-tetrachloro-fluorescein521nm538nmOrangeHEX5-hexachloro-fluorescein535nm553nmPinkTAMRAtetramethyl-6-carboxyrhodamine560nm582nmRoseROX6-carboxy-x-rhodamine587nm607nmRedCy3Indodicarbocyanine552

7、nm570nmRedCy5Indodicarbocyanine643nm667nmViolet24. Primer設(shè)計(jì)的基本原則是什么？答：引物設(shè)計(jì)的下列原則供您參考。引物長(zhǎng)度一般在18-35mer.G-C含量控制在40-60%左右。避免近3端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。如果可能避免在3端最后5個(gè)堿基有2個(gè)以上的G或C.如果可能避免在3端最后1個(gè)堿基為A.避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。退火溫度Tm控制在 58-60C左右。如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。25. 用軟件設(shè)計(jì)的引物為什么不管用？答：引物是否好用，能否擴(kuò)增出您需要的引物，與是否用軟件設(shè)計(jì)沒(méi)有太

8、多的關(guān)系。引物設(shè)計(jì)有一定的指導(dǎo)意見(jiàn)，軟件就是根據(jù)這些要求設(shè)計(jì)而成。不要迷信軟件給您設(shè)計(jì)的引物，軟件中一些參數(shù)您可能不明白，弄錯(cuò)了反而麻煩。其實(shí)，PCR擴(kuò)增的成敗最關(guān)鍵的是反應(yīng)模板的制備和反應(yīng)條件的控制。軟件設(shè)計(jì)最大的毛病是，有時(shí)判斷為該基因沒(méi)有一段區(qū)域滿足標(biāo)準(zhǔn)引物的要求。有時(shí)，我們需要擴(kuò)增一段基因片段，引物的設(shè)計(jì)是沒(méi)有太多的選擇的。26. 為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？答：我們多次接到類似的投訴：引物應(yīng)該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會(huì)有蛋白質(zhì)污染？遇到這樣的投訴有時(shí)我們感到很是為難。投訴者有時(shí)心情很不好，還不聽解釋。撇開其他不談，引物化學(xué)合成

9、，哪里有機(jī)會(huì)污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來(lái)衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過(guò)低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個(gè)20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base CompositionsBase CompositionA260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-32.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-31.855-CCCC

10、CCCCCCCCCCCCCCCC-31.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-31.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-31.6627. 同樣的OD用PAGE檢測(cè)，EB染色為什么深淺不一？答：通?？梢杂肊B染色的方法來(lái)判斷雙鏈DNA的量（如質(zhì)粒DNA），因?yàn)镋B可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA,由于堿基組成不同，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會(huì)有差異，比如Oligo（dT）等不形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來(lái)定量，而用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。同樣道理，用EB染色來(lái)照片不適合所有引物。28. 引物不純會(huì)有什么后果？答：引物

11、不純可能會(huì)導(dǎo)致：1）非特異性擴(kuò)增；2）無(wú)法用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物5端酶切位點(diǎn)的酶切開，特別是沒(méi)有保護(hù)堿基的引物；3） 用于測(cè)序出現(xiàn)雙峰或亂峰。解決辦法重新合成或重新純化。29. 為什么我們的引物重合了幾遍都擴(kuò)增不出來(lái)？答：有些PCR擴(kuò)增沒(méi)有成功，懷疑是引物不好。要求我們重合，沒(méi)有問(wèn)題?？墒怯袝r(shí)遇到重合數(shù)次的引物PCR擴(kuò)增還是不成功。這種情況的出現(xiàn)一般都是用戶自己的原因。對(duì)于引物合成，我們只能做到合成的引物沒(méi)有問(wèn)題，至于您是否能夠擴(kuò)增出來(lái)您需要的產(chǎn)物，那得靠您自己對(duì)實(shí)驗(yàn)本身的理解和把握。我們不能杜絕我們不犯錯(cuò)誤，但是引物合成犯同樣錯(cuò)誤的幾率很小，想犯同樣的錯(cuò)誤都難。PCR擴(kuò)增不成功的因素很多，需要您耐

12、心地分析，最好在實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)置對(duì)照來(lái)判定原因。如果您懷疑引物的問(wèn)題，請(qǐng)您首先測(cè)定您溶解的引物的OD值，看實(shí)驗(yàn)時(shí)加入的引物量是否正確。如果量是正常的，請(qǐng)您告訴我司您的引物編號(hào)，我們會(huì)復(fù)查留存樣品。如不明原因，我們免費(fèi)為您重新合成一次。如果仍然不能擴(kuò)增，請(qǐng)您查找其它原因。30. 已經(jīng)溶解的引物，為什么原先使用正常，而過(guò)一段時(shí)間再使用就不好了？答：如果您溶解引物的水PH過(guò)低或污染了菌或核酸酶，會(huì)使引物降解。使用時(shí)沒(méi)有充分解凍混合，液體不均勻也可能會(huì)造成引物加入量不準(zhǔn)確。建議分裝引物，避免反復(fù)凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物，因?yàn)橐驗(yàn)橛行┱麴s水的pH值比較低（pH4-5）， 引物

13、在這種條件下不穩(wěn)定。還有一種可能性是引物沒(méi)有問(wèn)題，而是PCR使用材料特別是模板的質(zhì)量與先前使用的不完全一致。31. 引物質(zhì)量好壞的判斷標(biāo)準(zhǔn)是什么？答：合成的引物和您的定單序列一致，而不是能否擴(kuò)增出您所需要的產(chǎn)物。32. 引物是我們?cè)O(shè)計(jì)的，現(xiàn)在您擴(kuò)不出來(lái)，我們要負(fù)責(zé)嗎？答：不負(fù)責(zé)任。我們免費(fèi)為一些實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)不足的人員，免費(fèi)設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)好，我們都會(huì)發(fā)給您確認(rèn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)我們遵循一般的指導(dǎo)原則，但是設(shè)計(jì)的引物是否能夠滿足您的實(shí)驗(yàn)要求，擴(kuò)增出您需要的基因片段，我們就不能保證了。我們遇到一些用戶，他們講：引物是你們?cè)O(shè)計(jì)的，也是你們合成的，我做不出，你們就要付責(zé)任。聽到這樣的抱怨，覺(jué)得心寒。33. P

14、CR擴(kuò)增不出就引物有問(wèn)題嗎？答：基本不是。當(dāng)今發(fā)展出各色各樣的PCR擴(kuò)增技術(shù)，各色各樣的高溫聚合酶，就是來(lái)解決PCR擴(kuò)增中遇到的擴(kuò)不出，擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。如槽式PCR就是擴(kuò)增那些拷貝數(shù)很低的基因片段。 有些重復(fù)片段的擴(kuò)增， GC含量高的片段，非要采用特殊擴(kuò)增手段才能擴(kuò)增出了。引物擴(kuò)增不出，主要是下列兩種情況比較常見(jiàn)（1） RT-PCR.請(qǐng)注意，很多基因通過(guò)常規(guī)RT PCR方法是很難不增出來(lái)的。 RT- PCR成功的關(guān)鍵在于RT的反應(yīng)的RNA質(zhì)量和目標(biāo)基因在特定組織和細(xì)胞中含量。（2）從基因組中擴(kuò)增。一般情況下，基因在基因組中都是單拷貝，基因組作為模板需要嚴(yán)格控制用量?；蚪MDNA過(guò)高，會(huì)影響反應(yīng)體系中的Mg和pH.34. PCR擴(kuò)增有很強(qiáng)的非特異條帶，說(shuō)明引物有污染嗎？答：不能。瞧，擴(kuò)增目標(biāo)很弱或沒(méi)有，道是非特異性條帶很亮，說(shuō)明引物不純或有污染。一些用戶如是說(shuō)。我們?cè)治鲞^(guò)一些非特異條帶，測(cè)序發(fā)現(xiàn)在這些非特異性片段的兩頭至少可以發(fā)現(xiàn)一條引物序列。我們只能說(shuō)非特異性擴(kuò)增一般是模板污染（如RNA中污染基因組）或擴(kuò)增條件不合適所致。35. 引物合成的價(jià)格合理嗎，還有下浮的空間嗎？答：不合理。對(duì)引物合成的成本，我們做了準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)和評(píng)估，認(rèn)為現(xiàn)階段引物的價(jià)格處于一種非理性化狀態(tài)，價(jià)格已基本探底。引物合