成骨、成脂誘導(dǎo)【精選文檔】

1、成骨、成脂誘導(dǎo)【精選文檔】間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)制作方法· 瀏覽:185· · 更新：201307-01 11：12間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)必然用到的就是培養(yǎng)液，配置出合適的培養(yǎng)液能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化，因此這一步操作時(shí)相當(dāng)?shù)年P(guān)鍵。如何才能配置適合的誘導(dǎo)培養(yǎng)液呢?濟(jì)南中賽生物來(lái)介紹成骨與成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配備方法。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液配備與誘導(dǎo)操作:1.準(zhǔn)備含10%FBS的MEM培養(yǎng)液;2。在備好的-MEM培養(yǎng)液中添加50M 抗壞血酸, 10mm磷酸甘油和100nm地塞米松；3。準(zhǔn)備6孔培養(yǎng)板,將P4細(xì)胞按照5×103個(gè)/平方厘米的規(guī)格接種于原始

2、MEM培養(yǎng)液中；4。待細(xì)胞長(zhǎng)至基本融合后，更換上述制備完成的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液；5。每三天換液一次,細(xì)胞長(zhǎng)至7天時(shí)進(jìn)行堿性磷酸酶染色;6。二十八天后再進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色.茜素紅染色方法介紹:1.去除細(xì)胞當(dāng)前使用培養(yǎng)液，使用PBS清洗兩次;2。使用10甲醛室溫固定15分鐘,完成后使用重蒸餾水沖洗兩次；3。按照1ml/孔加入40mM的茜素紅染色液，室溫孵育20min并輕微振蕩;4。清除掉沒(méi)有完全結(jié)合的染料，用重蒸餾水漂洗并振蕩5min重復(fù)4次；5。傾斜放置2min,吸取多余的重蒸餾水；倒置顯微鏡觀察拍照記錄.成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液配備與誘導(dǎo)操作：1.配置FBS10含量的HG-DMEM培養(yǎng)液；2.在配制完

3、成的HG-DMEM培養(yǎng)液中加入1M地塞米松，10g/ml胰島素，200M吲哚美辛和0.5mM IBMX；3。準(zhǔn)備6孔培養(yǎng)板，將P4細(xì)胞按照2×104個(gè)/平方厘米的規(guī)格接種于原始HGDMEM培養(yǎng)液中4.待細(xì)胞長(zhǎng)至基本融合后,更換上述制備完成的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)2天,在用只含有10g/ml胰島素的成脂維持培養(yǎng)液培養(yǎng)1天,如此交替循環(huán)培養(yǎng)至14天，使用紅油O染色。紅油O染色方法介紹：1.去除細(xì)胞使用的當(dāng)前培養(yǎng)液,使用PBS清洗兩次;2.27。5甲醛室溫固定20分鐘;3.重蒸餾水清洗3此，空氣中干燥；4.加入0。5%的紅油室溫孵育一小時(shí)；5。配制70乙醇溶液清洗3次；6.倒置顯微鏡觀察拍照記

4、錄.丁香園二、誘導(dǎo)成骨體系1試 劑  溶 劑  終 濃 度  儲(chǔ) 存 濃 度  1ml體系加量Dex  去離子水  0。1M  1mM  0。1LVc  PBS  50M  50mM  1L-磷酸甘油  PBS  10mM  1M  10L2DMEM（HG）和10FBS.33代以

5、上細(xì)胞，,24孔板每孔105個(gè)細(xì)胞,六孔板每孔6000個(gè)細(xì)胞，每三天半量換液,共誘導(dǎo)2周。成骨誘導(dǎo)劑：地塞米松（1×108mol/L)，甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C 50ng/ml，高糖DMEM，青鏈霉素各100u/ml，體積分?jǐn)?shù)10的胎牛血清。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分:兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基175 mL兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 mL谷氨酰胺2 mL雙抗2 mL抗壞血酸400 L甘油磷酸鈉2 mL地塞米松20 L成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分：兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基A175 mL兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)專用胎牛血清2

6、0 mL谷氨酰胺2 mL雙抗2 mL胰島素400 LIBMX（IBMX, 3-異丁基1-甲基黃嘌呤)200 L羅格列酮(吲哚美辛）200 L地塞米松200 L兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基B175 mL兔骨髓間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)專用胎牛血清20 mL雙抗2 mL谷氨酰胺2 mL胰島素400 L對(duì)成脂肪誘導(dǎo)要特別提醒你，用國(guó)產(chǎn)血清比進(jìn)口的效果更好（仍為10濃度)。我用的是SIGMA的地塞米松(D1756），25mg包裝的,248元貴的驚人！須用無(wú)水乙醇溶解。我也用過(guò)病房常用的5mg的地塞米松磷酸鈉，效果也挺好的。首選的是dexamethasone-wate

7、r soluble,cell culture tested。至少可以配成1：1000的母液，使用起來(lái)很方便。使用醫(yī)用制劑尤其要小心溶劑的問(wèn)題,好些制劑不是融解在水里的，如果你沒(méi)有設(shè)置合適的陰性對(duì)照，會(huì)給你的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)Bug.脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液：DMEM，10FCS,106M地塞米松，100微克ml 1一甲基一3一異丁基一黃嘌呤，50微克ml抗壞血酸.很難找到一套抗兔的抗體。油紅染色的方法如下:脂肪油紅染色（原位）：1.稱取0。5g油紅干粉，溶于100mL異丙醇中,配成0。5%油紅儲(chǔ)存液，棕色瓶保存.2.除去培養(yǎng)基用PBS洗滌1遍3.加10中性甲醛固定5min4.稀釋油紅儲(chǔ)存液，油紅；去離子水3：2，濾紙過(guò)濾，室溫放置10min(除去一些雜質(zhì)，染色結(jié)果更清晰）5。染色30min，如果是培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板，加的體積覆蓋住板底即可。如6孔加1。5ml，24孔加0.51ml.6。 顯微鏡觀察，及時(shí)照相，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，脂肪滴會(huì)自發(fā)破裂,到時(shí)就前功盡棄了，幾個(gè)星期的努力歐！這位大蝦的油紅染色方法基本正確，但有幾個(gè)地方修改一下后效果會(huì)更好！