雙光子顯微鏡技術(shù)

1、雙光子顯微鏡技術(shù)作者：細胞生物組劉洋 完整ppt請見附件雙光子顯微鏡問世于上世紀90年代，是結(jié)合了激光共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的產(chǎn)物。目前，雙光子顯微術(shù)以其大穿深、低光毒性、低光漂白等優(yōu)點而被廣泛應用于活體和活細胞/組織的成像觀察。本報告將對雙光子顯微鏡發(fā)明的背景、實現(xiàn)方式、技術(shù)特點、應用領(lǐng)域及發(fā)展趨勢進行簡要介紹。一、 雙光子顯微鏡發(fā)明的背景光學顯微鏡的發(fā)展歷史是一段不斷提高分辨率的歷史。在傳統(tǒng)寬場（Widefield microscope, WF）光學顯微鏡中，來自標本不同縱深的光線都可以投射到同一焦平面上（視網(wǎng)膜或感光元件在此），導致被接收的光線90%是來自焦平面外的雜散光，因此寬場

2、顯微鏡的成像是整個標本的重疊像，沒有縱向分辨能力。對標本內(nèi)部細節(jié)的表現(xiàn)很差，嚴重影響了分辨率。為了消除雜散光的干擾，Malvin Minsky于1957年提出了一種利用狹小針孔（Pinhole）濾除焦平面外雜散光的設(shè)想，并由G. J. Brakenhoff于1978年借助激光最終實現(xiàn)，這就是激光共聚焦顯微鏡（Laser scanning confocal microscope, confocal）。與寬場顯微鏡不同的是，激光共聚焦顯微鏡在成像側(cè)的焦點位置設(shè)置了一個針孔，只允許來自另一個焦點的熒光通過，而來自其他焦平面的雜散光則被屏蔽。通過焦點的熒光被感光元件（光電倍增管、CCD或CMOS）接收

3、，形成一個點的熒光強度信號。為了解決二維成像問題，激發(fā)光通過一組高速擺動的振鏡，在標本上進行X-Y方向掃描，來自掃描區(qū)域內(nèi)各點的信號最后通過計算機重新合成為一張圖片。由于有效濾除了雜散光，激光共聚焦顯微鏡的分辨率相比寬場顯微鏡有了本質(zhì)上的提高（橫向200nm，縱向400nm），擁有了對樣本的特定焦平面進行精細成像的能力（稱為光學切片或“細胞CT”），解決了標本內(nèi)部細節(jié)的問題。在此基礎(chǔ)上，激光共聚焦顯微鏡能夠結(jié)合多種其它參數(shù)，得到重建后的三維圖像（XYZ模式）、動態(tài)圖（XYt模式）或光譜圖（XY）等數(shù)據(jù)，以供后續(xù)的形態(tài)學、動力學等定量分析。然而，針孔在濾除雜散光的同時也濾除了大部分焦平面熒光，僅

4、有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度，勢必要加大激發(fā)光功率，容易增加對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白。因此，激光共聚焦顯微鏡在活細胞/組織成像上的應用受到了一定局限。此外，激發(fā)光在穿透標本的過程中會被標本大量散射，以及因激發(fā)沿途熒光而損耗，所以對300um以上厚標本的深部成像并不理想，限制了激光共聚焦在厚樣本成像上的應用。自從上世紀80年代以來，人們一直尋求降低共聚焦顯微鏡光害、增加靈敏度和穿深的技術(shù)改進。直到1990年，雙光子顯微鏡應運而生。二、 雙光子顯微鏡的原理及技術(shù)特點1931年，原子物理學家Maria Goeppert-Mayer預言一個分子或原子可以在同一個量子過程中，同時吸

5、收兩個/多個光子而成激發(fā)態(tài)，即所謂的雙/多光子激發(fā)（吸收）。1961年，Kaiser等借助激光在CaF2Eu2+晶體中首次觀察到了雙光子激發(fā)現(xiàn)象。1990年，Winfried Denk利用雙光子激發(fā)改造激光共聚焦顯微鏡，發(fā)明了雙光子顯微鏡。什么是雙光子激發(fā)？這要從產(chǎn)生熒光的機理講起。在普通狀態(tài)下，基態(tài)熒光分子吸收一個激發(fā)光的光子后，其電子被激發(fā)到一個能量較高但不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)電子隨即回到基態(tài)，同時將多余的能量以發(fā)射光子的方式放出，這就是單光子激發(fā)。由于整個過程中存在非輻射的能量損失，發(fā)射出的光子能量總是要小于激發(fā)光子，也就是發(fā)射光的波長大于激發(fā)光。而在雙光子激發(fā)的情況下，熒光分子可以連續(xù)

6、吸收兩個波長為原來兩倍的激發(fā)光子來產(chǎn)生與單光子激發(fā)同樣的效果。例如在單光子激發(fā)中，NADH酶分子吸收一個350nm光子，發(fā)射出一個450nm光子；而在發(fā)生雙光子激發(fā)時，吸收兩個700nm光子，也可以發(fā)射出一個450nm光子。同理，也可有三光子激發(fā)乃至多光子激發(fā)，但更難發(fā)生。雙光子激發(fā)的條件非?？量?。熒光分子在吸收了第一個激發(fā)光子后，等待吸收第二個光子的中間態(tài)只能維持10-17s （0.01fs），這要求激發(fā)光束中相鄰兩個光子的間隔必須小到10-18s （1as）才能確保發(fā)生雙光子激發(fā)，換算成激發(fā)光的功率密度高達51012 W/cm2。任何生物標本都無法經(jīng)受如此高功率的激光照射。為了解決這個問題

7、，雙光子顯微鏡普遍使用可調(diào)諧的鎖模紅外激光器輸出飛秒級的脈沖激光。每個激光脈沖長約10-13s（100fs），強度足夠發(fā)生雙光子激發(fā)，而兩個脈沖間有10-8s（10ns）的間隔，使整個光束的平均能量密度下降到略高于普通共聚焦激光的水平。雙光子激發(fā)對激發(fā)光能量要求極高，所以只能在光子密度最高的物鏡焦點周圍發(fā)生。相對于整個光路上都產(chǎn)生熒光的單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)很少產(chǎn)生焦平面以外的雜散光，因此：1）雙光子顯微鏡可以不需要針孔，提高了熒光信號收集率，靈敏度隨之得到提高；2）雙光子顯微鏡的光毒性和光漂白僅發(fā)生在焦點周圍的極小區(qū)域（約1um3），非常適合對活細胞、活組織的長時間成像觀察。光線在介質(zhì)中的散

8、射能力與波長四次方成反比，因此雙光子激發(fā)使用的近紅外波段激光在厚樣本中不易被散射、損耗，穿透力遠強于普通共聚焦激光。在一般情況下，雙光子激發(fā)光能夠輕易達到1mm以上的穿透深度，此時的成像深度僅受發(fā)射熒光的信噪比限制。尤其適用于毫米級厚樣本、不透明樣本及含色素樣本的成像。比起單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)的吸收峰和發(fā)射峰距離更遠，更能避免光譜重疊，有助于提高對比度和減少假陽性信號的出現(xiàn)。此外，同一種染料的雙光子吸收譜往往比單光子吸收譜更寬，因此可以用一種雙光子激發(fā)光同時激發(fā)數(shù)種不同的短波長熒光。這樣，在沒有紫外激光器的情況下也能使用AlexaFluor 350這樣的短波長染料，增強熒光搭配的靈活性。雙光

9、子顯微鏡的大穿深、低光害使其迅速成為活細胞、組織和胚胎觀察的有力手段。然而它自身也存在諸多限制，不能取代目前共聚焦顯微鏡的地位：1）雙光子顯微鏡的分辨率達不到普通共聚焦的水平（約差一半），成像速度無明顯提高；2）雙光子顯微鏡焦點處的光漂白和光毒性強于單光子顯微鏡；3）雙光子激發(fā)光的熱效應強，對部分活標本影響較大； 4）不能用于對紅外光強吸收的樣本；5）雙光子顯微鏡的激光器較復雜，購置和維護成本遠高于一般激光器。因此，對是否選擇雙光子成像的問題，要結(jié)合自己需求和適用條件進行分析，能用共聚焦顯微鏡解決的問題，就無需使用雙光子顯微鏡。三、 雙光子顯微術(shù)的應用雙光子顯微鏡自1990年誕生以來已被廣泛地

10、應用于神經(jīng)生物學、細胞生物學、代謝組學、信號轉(zhuǎn)導等生命醫(yī)學領(lǐng)域。以下列舉一些雙光子顯微鏡解決的科學問題。細胞形態(tài)學分析雙光子成像極強的穿透能力使得人們能夠輕松地獲得活體深層組織中特定細胞的三維形態(tài)信息，并在此基礎(chǔ)上進行諸如數(shù)量、尺度、體積、形狀、突起形態(tài)、熒光強度等定量分析。引用圖片展示了小鼠視皮層中間神經(jīng)元在對小鼠進行暗室飼養(yǎng)后發(fā)生的突起形態(tài)變化。離子信號檢測雙光子成像與離子探針聯(lián)用，能夠?qū)崟r觀察并量化在體神經(jīng)元或其它細胞中的離子信號，使得雙光子顯微鏡的應用進入電生理領(lǐng)域。引用圖片展示了小鼠聽覺皮層椎體神經(jīng)元的樹突棘對聽覺刺激的兩種不同響應方式。細胞運動跟蹤雙光子成像結(jié)合細胞標記技術(shù)，能夠?qū)?/p>

11、特定組織中標記細胞的分布、活動范圍、遷移路線、遷移速度、細胞間相互作用等特征進行測量。引用圖片展示了類風濕模型小鼠腘窩淋巴結(jié)中Naive和 antigen-experienced 兩種T細胞的運動模式。血流動力學通過直接對組織微小血管中的紅細胞流進行延時成像，人們已經(jīng)能夠測算出血液的流速和血壓并建立血流動力學模型。而這在之前是難以想象的。引用圖片展示了小鼠腦微小血管的血壓波動及血壓分布模型。胞內(nèi)活動檢測雙光子成像不僅被廣泛用于記錄組織細胞水平上的各種動態(tài)，同樣可以應用于囊泡轉(zhuǎn)運、細胞骨架、細胞凋亡、分子代謝等胞內(nèi)動態(tài)過程的監(jiān)測和分子動力學模型的構(gòu)建。引用圖片展示了大鼠胰島beta細胞中胰島素囊

12、泡外吐的兩種不同方式。新陳代謝監(jiān)測通過直接對組織中某些具有自發(fā)熒光的生物活性分子（如NADH、FADH2）進行雙光子激發(fā)，可以對組織的物質(zhì)和能量代謝情況進行監(jiān)測。引用圖片展示了通過NADH自發(fā)熒光水平反映的小鼠冠狀動脈末梢區(qū)的供氧情況。四、 雙光子顯微鏡的發(fā)展趨勢目前，針對雙光子顯微鏡的各種缺點，科學家們也在對其進行著各種技術(shù)革新，以求獲得一種集雙光子和共聚焦優(yōu)點于一身的新型成像技術(shù)。提升掃描速度聲光振鏡：使用無機械元件的聲光振鏡取代現(xiàn)有的電光振鏡，從根本上提高掃描速度。多焦點復合掃描：將一束雙光子激光通過分光和延時形成數(shù)個光束，分別掃描標本上不同的位置或深度。提高靈敏度二次諧波成像技術(shù)（SHG）當強激光穿過非線性光學介質(zhì)時，能夠產(chǎn)生波長減半的二次諧波。整個過程不發(fā)生熒光激發(fā)，也就不需要熒光染色，更沒有光毒性和光漂白。二次諧波同雙光子激發(fā)一樣屬非線性光學現(xiàn)象，對物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)高度敏感，有助于提高成像靈敏度。值得注意的是，二次諧波產(chǎn)生的條件與雙光子激發(fā)相似，因此二次諧波成像與雙光子顯微鏡高度兼容，可在現(xiàn)有落射式雙光子顯微鏡的基礎(chǔ)上增加透射式的二次諧波檢測器，升級為二次諧波雙光子顯微鏡。提高分