腫瘤組織庫的建立與管理ppt課件

1、1腫瘤組織庫的建立與管理腫瘤組織庫的建立與管理2研究目的 探討分子生物學研究中腫瘤庫的建庫條件，標本的采集、保存和質量控制，以及腫瘤庫的信息化管理等有關問題，創(chuàng)建腫瘤組織標本庫，保護和合理利用腫瘤的標本資源，為臨床和科學研究人員，提供合適數(shù)量的腫瘤標本促進腫瘤的研究。3目錄建庫理論基礎材料與方法結果討論致謝4理論基礎一、建立組織庫的三種模式1.“銀行”模式 2.臨床試驗模式 3.前瞻性收集模式 5理論基礎“銀行銀行”模式的組織庫：模式的組織庫：按照一定的標準化運轉程序（standard operating processeds, SOPs）規(guī)范人體組織的收集、加工和儲存。組織標本形式：組織標本

2、形式：通常為低溫冷凍組織或蠟塊。缺點：缺點：不能提供新鮮的、未被冰凍的人體組織，亦不能提供某些有特殊加工需求的組織樣本。不能滿足研究者對組織塊的個性化需求。優(yōu)點：優(yōu)點：可向研究者提供大量的組織樣本，并且這些組織均有相關的臨床信息和流行病學信息。6理論基礎臨床試驗模式：臨床試驗模式：是”銀行“模式的一個亞型，是由一個或多個臨床試驗收集的標本構成的標本庫。缺點：缺點：其內(nèi)組織標本的應用受限于倫理委員會的要求，無法被廣泛的應用與其他臨床研究。同樣，組織的大小、采集及加工的方法也不能滿足所有研究者的需求。 7理論基礎前瞻性收集模式：前瞻性收集模式：研究者指定需要的組織類型，同時也制定出所需的組織采集、

3、處理及儲存方法。缺點：缺點：沒有現(xiàn)成的大量的組織標本以及臨床資料，因為組織需要前瞻性的去收集。優(yōu)點：優(yōu)點：研究者能獲得他們需要的組織樣本，能夠滿足其研究的個性化需求。8理論基礎二、組織收集盡量縮短和記錄手術摘除或從手術室轉移到標本庫的時間間隔很重要Spruessel等人報道，組織離體后30分鐘內(nèi)稱80%基因變化少于2個折疊1 Maine等人報道，前列腺組織離體1小時內(nèi)僅有不到1%基因發(fā)生了變化2 術后標本在體外保存5分鐘和60分鐘相比，其mRNA變化不明顯31.Spruessel A, Steinmann G, Jung M, Lee SA, Carr T, Fentz AJ, Spangen

4、berg J, Zornig C, Juhl HH, David KA. Tissue ischemia time affects gene and protein expression patterns within minutes following surgical tumor excision. Biotechniques. 2004;36(6):10301037. 2. Maine IP, Varambally S, Shen R, Chinnaiyan M, Rubin MA. Changes in differential gene expression because of w

5、arm ischemia time of radical prostatectomy specimens. Am J Pathol.2002;161(5):17431748. 3. Huang J, Qi R, Quackenbush J, Dauway E, Lazaridis E, Yeatman T. Effecs of ischemia on gene expression. J Surg Res. 2001;99:222227. 9理論基礎三、組織儲存北京大學季加孚等研究發(fā)現(xiàn)：手術后1 h內(nèi)取材的組織經(jīng)過3年低溫保存，90以上的標本仍有清晰的28S和18S RNA條帶，提示RNA完整

6、性較好4DNA分子穩(wěn)定性較mRNA好，在-80環(huán)境中保存5年，DNA完整性良好54.季加孚北京大學臨床腫瘤學院腫瘤標本庫的建設J北京大學學報：醫(yī)學版，2005，37(3)：329330 5.張佳年， 于穎彥， 計駿.等. 低溫凍存時間對腫瘤組織生物大分子的影響J. 診斷學理論與實踐 2009，V018，No110材料與方法腫瘤組織庫庫房，放置液氮罐、冰箱、冰柜等冷凍設備，用于存放標本；分子生物室（中心實驗室）用于提取血清、血漿、分離淋巴細胞。庫房設備：液氮罐1個（YDS-30，沈陽新光）， -80立式超低溫保存箱2臺（DW-86L628，青島海爾），4-20冰柜1臺（BCD-130Eb，青島海

7、爾）；聯(lián)想電腦、條碼掃描器、條碼打印機1套（BP-IP300，德國BRADY）等。11庫房12生物樣本庫資源信息管理系統(tǒng)13主要設備BRADY條碼打印機液氮罐海爾-80冰箱14患者入院后行生物安全性檢查。檢測HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情況。HIV感染患者不列為采集對象。HBV及HCV感染者需在標本上明確注明。尊重患者的知情權和隱私權，在向患者及家屬介紹標本采集和使用目的，獲得患者自愿簽署知情同意書后，方可安排標本采集和數(shù)據(jù)錄入。15組織采集手術結束后，標本離體30分鐘內(nèi)完成，在臨床腫瘤專家的指導下，在不影響病理診斷取材需要的前提下，采集組織樣本。1）標本取材部位：腫瘤組織、癌旁組織（

8、癌組織旁1cm）和正常組織（癌組織旁5cm及以外或最遠處）。2）過程：使用數(shù)碼相機拍攝標本外觀后，將標本切成小塊（直徑0.50.5cm，厚度0.5cm），為減少處理時間，標本不應切得太小，然后放入無菌凍存管內(nèi)，做好標記，記錄標本采集的時間及標本的類型。每例病人樣本保存35份凍存管標本。每份組織重量原則不低于2g。3）標本凍存管標記后直接凍存于液氮中，后轉移至-80冰箱中。標本運送過程中，將其置于冰中保存。 16術前血：指臨床診斷明確，患者未經(jīng)任何治療，即放療、化療及免疫治療等，已接受上述治療的患者樣本需詳細注明。術后血：指接受手術后2周，患者未接受任何放療、化療或免疫治療等。171、取血液標本

9、，每例采集10ml（不少于5ml），約10ml全血平均分裝于紅帽管（不含抗凝劑，1管）和紫帽管（含2%EDTA抗凝劑，2管）中。2、紅帽管用于分離血清，室溫放置30分鐘后離心；紫帽管用于分離血漿及淋巴細胞。3、1500r/min離心10分鐘，此時懸液分層，上層淡黃色為血清（紅帽管）或血漿（紫帽管），底層為紅細胞，紫帽管中中層呈灰白色的為外周血淋巴細胞。4、輕輕吸取淡黃色上層血清（血漿）放入1.5ml離心管中，每管200l，共12管（血清6管，血漿6管），做好標記。5、新鮮抗凝血（含2%EDTA抗凝）去血漿后，按照1:1比例加入PBS液混勻。6、15ml離心管內(nèi)先加入3ml淋巴細胞分離液，后加入

10、6ml稀釋樣品，注意加入樣品要緩慢進行，不要沖破液面，影響離心效果。202下2000r/min離心20分鐘。7、離心后血樣分四層，將移液管插入液面，輕吸灰白色的淋巴細胞層，放入另一15ml離心管中，注意吸取過程中避免吸入分層液和血漿。8、按1:5的比例向淋巴細胞中加入PBS液，混勻洗滌，室溫1000r/min離心10min。9、棄去上清液保留底部沉淀，適用1.5mlPBS液吹打洗滌，置入標記好的1.5ml細胞凍存管中，高速離心機500r/min離心5分鐘。10、棄去上清液保留底部沉淀，血清、血漿及淋巴細胞分裝完畢后貼好二維標簽。18質量控制樣本DNA完整性檢測方法一：提取樣本基因組DNA，檢測

11、OD260/OD280值。進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳。通過DNA電泳判斷組織標本的基因組是否完整。無基因組DNA或DNA出現(xiàn)明顯降解為不可用樣本。方法二：通過PCR選擇擴增管家基因，如GAPD、HHPRT、-actin，分析擴增產(chǎn)物的含量。產(chǎn)物含量相對較少或無產(chǎn)物，可判斷為不可使用標本。19質量控制樣本RNA完整性檢測方法一：參照Trizol 試劑盒操作指南進行組織總RNA 的提取。應用紫外分光光度計測260 nm、280 nm OD值定量分析RNA（OD 260/OD 280為1.7-2.0）；1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察5 S、18 S和28 S條帶情況。28 S和18 S條帶亮度的比值約2:

12、1，表明標本中的RNA完整性較好。出現(xiàn)降解者為不可用樣本。方法二：RT-PCR擴增-actin、HHPRT管家基因，分析擴增產(chǎn)物的含量，產(chǎn)物含量相對較少或無產(chǎn)物可判斷為不可用樣本。方法三：Northern Blot檢測-actin、HHPRT管家基因，無印記者列為不可使用樣本。20蛋白質完整性檢測蛋白質完整性通過Western Blot進行檢測，檢查標本樣本中-actin的蛋白表達量變化，通過分析印記條帶，判斷蛋白量是否有變化，無條帶或條帶變?nèi)跽邽榘l(fā)生組織降解樣本。21結果自2010年7月建庫以來共收集保存了各類腫瘤（胃癌、結腸癌、直腸癌、甲狀腺癌、胃腸道間質瘤等）患者的組織標本1333例，胃癌患者424例，直腸癌267例，結腸癌246例，甲狀腺腫瘤254例，胃腸道間質瘤45例，其他類型腫瘤97例。標本總量11919份，其中包括腫瘤組織1170份，腫瘤旁組織900份，正常組織1113份，血清3923份，血漿3931份，淋巴細胞843份，糞便39份。已向外省提供60份患者血淋巴細胞樣本，用于DNA相關研究，效果良好。22隨機抽取近1年的組織樣本20例，用Trizol試劑提取組織總RNA，測量各標本的OD260/OD280比值均在1.8-2.0之間。1%瓊脂糖凝膠電泳后，28 S和18 S條帶清晰明亮，5 S條帶很弱，且