ISO標準參考譯文沙門氏菌檢驗基準方法

1、國際標準ISO6579食品和動物飼料的微生物學(xué)沙門氏菌檢測的基準方法內(nèi)容1范圍2參考標準3定義4原理4.1概要4.2前增菌一一非選擇性液體培養(yǎng)基4.3增菌一一選擇性液體培養(yǎng)基4.4劃平板和鑒定4.5確認5培養(yǎng)基、試劑和血清1概要1培養(yǎng)基和試劑1血清6設(shè)備和玻璃器皿7采樣8檢驗樣品的制備9程序試驗樣品和原始懸浮液非選擇性前增菌選擇性增菌劃平板和鑒定確認10結(jié)果表示11檢驗報告12質(zhì)量保證附錄A（標準化）程序圖表附錄B（標準化）培養(yǎng)基和試劑的成份及準備附錄C（非標準化）實驗室間試驗結(jié)果參考書目前言ISO（國際標準化組織）是國際標準化團體的全世界同盟。通常由ISO技術(shù)委員會來執(zhí)行國際標準的制訂工作（

2、ISO成員體）。通常由ISO技術(shù)委員會來完成國際標準的準備工作。在委員會中，若對建立的技術(shù)委員會有興趣的話，每個成員體有權(quán)作為代表。國際組織、政府或非政府組織，通過ISO聯(lián)系，也可以參加這項工作。在所有電工標準方面，ISO與國際電工委員會（IEC）緊密合作。國際標準按照ISO/IEC指南第三章所列的規(guī)則草擬。技術(shù)委員會的主要任務(wù)是準備國際標準。被技術(shù)委員會采用的國際標準草案以投票方式在成員體內(nèi)運行。至少要75城員體的投票贊成，才能作為一個國際標準發(fā)布。要引起注意的可能性是：本國際標準的一些要素可能是專利權(quán)主體。ISO不應(yīng)承擔鑒定部分或全部的這種專利權(quán)。ISO6579是由食品ISO/TC34技術(shù)

3、委員會、微生物SC盼委員會所準備的。第四版刪除或更換了第三版（ISO6579:1993）,并已作了技術(shù)性修訂。附錄A和附錄B形成了本國際標準的標準化部分。附錄C僅為資料。介紹因為有大量的不同種類的食品和飼料產(chǎn)品， 本基準方法可能對某些產(chǎn)品并不完全適用，而另一些產(chǎn)品可能得用到其他方法。既然這樣，如果為論證技術(shù)上的原因而絕對需要時，那么就可使用這些產(chǎn)品指定的不同方法。不過，應(yīng)盡可能地使用本基準方法。在下一次審查這個國際標準時， 我們會考慮所有有用關(guān)于這些指標所涉及的范圍內(nèi)以及個別產(chǎn)品不遵照這些指標的原因的信息。（產(chǎn)品的）檢測方法無法在短時間內(nèi)達到統(tǒng)一，而且，對于某些產(chǎn)品，可能已經(jīng)有與本基準方法不符

4、的國際標準/或國家標準存在。但是我們希望，在以后審查這些標準時能進行修改，使其同本國際標準保持一致，以保證除了因技術(shù)原因確實需要外不會發(fā)生背離本基準方法的情況.微生物學(xué)一一檢測沙門氏菌方法的通用指南警告一一為了保護實驗室工作人員的身體健康，在適當裝備的實驗室、在熟練的微生物學(xué)家的控制下檢測沙門氏菌、特別是傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌，這是非常關(guān)鍵的。另外最要關(guān)注的是所有培養(yǎng)物的處置。1范圍本國際標準詳述了沙門氏菌的基準方法，包括傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌。在緒論中受討論的局限性，本國際標準適用于一一供人類消費或動物飼養(yǎng)所使用的產(chǎn)品。一一在食物生產(chǎn)和處理范圍內(nèi)的環(huán)境樣品。警告一一本方法并不包括

5、所有的傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌。2標準的參考資料通過本文中的參考目錄，下列標準化文件包含組成本國際標規(guī)定的條款。對后來更正或修訂的陳舊參考資料，這些條款并不適用。然而，鼓勵那些基于贊同本國際標準的成員，去調(diào)查下面提到的大多數(shù)新版標準化文件應(yīng)用的可能性。對更新的參考資料，最新版的標準化文件作了參考應(yīng)用。ISO和IEC的成員保持對現(xiàn)行有效國際標準的注冊。ISO6887-1,食品和動物飼料的微生物學(xué)一一微生物檢驗中測試樣品、 原始懸浮液及十倍稀釋液的制備一一第一章：原始懸浮液和十倍稀釋液制備的通用規(guī)則ISO7218:1996,食品和動物飼料的微生物學(xué)微生物檢驗的通用規(guī)則ISO8261,牛奶及奶制

6、品一一微生物檢驗中測試樣品、原始懸浮液及十倍稀釋液制備的通用指南3術(shù)語和定義應(yīng)用下列定義來表達本國際標準的用途。沙門氏菌：在選擇性培養(yǎng)基上形成典型或少典型的菌落，當依照本國際標準進行試驗時，它們表現(xiàn)出特有的生化反應(yīng)和血清學(xué)特征的微生物。沙門氏菌檢測：當依照本國際標準進行試驗時，在一定重量或體積的產(chǎn)品中，測定這些沙門氏菌的存在與否。4原理1概要沙門氏菌檢測需四個連續(xù)階段（也可以見附錄A）注沙門氏菌可能少量存在，并經(jīng)常伴隨著相當數(shù)量的其它腸桿菌屬或其它菌屬。因此，選擇性增菌是必需的；此外，為盡可能地檢測到受傷沙門氏菌，經(jīng)常需要進行前增菌。1警增菌一一非選擇性液體培養(yǎng)基將試驗部分接種于緩沖蛋白陳水，

7、在37C1C培養(yǎng)18h土2h0對于某些食品，則需利用其它的前增菌程序，見9.1.2o數(shù)量比較龐大時，在接種測試樣品前應(yīng)將緩沖蛋白陳水加熱到37cTCo1增菌一一選擇性液體培養(yǎng)基將4.2得到的培養(yǎng)物接種到RVS肉湯和MKTT吶湯。RV的湯在41.51C孵育24h3h,MKTT的湯在37土1C孵育24h3hc1劃平板和鑒別從4.3中獲得的培養(yǎng)物接種于兩種選擇性固體培養(yǎng)基上。一一木糖賴氨酸月氧膽鹽瓊脂（XLD脂）增一對XLD瓊脂的任何其它補充性的選擇性培養(yǎng)基，特別是適合于分離乳糖陽性的沙門氏菌、傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)基，實驗室可以選擇使用。XLD瓊脂在371C孵育，在24h3h后檢查結(jié)果

8、。第二種選擇性瓊脂按照廠家說明書進行孵育。注作為資料，亮綠瓊脂、亞硫酸鈿瓊脂等，可用作第二種平板劃線培養(yǎng)基。1確認挑選可疑沙門氏菌的菌落進行次培養(yǎng)，再按4.4所描述的劃線分離，通過適當?shù)纳囼灪脱鍖W(xué)試驗加以證實。5培養(yǎng)基、試劑和血清概要供常規(guī)實驗室使用，見ISO7218。培養(yǎng)基和試劑注由于培養(yǎng)基和試劑的數(shù)量龐大，為了表述清晰，我們認為將它們的組成和配制在附錄B中列出更適當。非選擇性前增菌液：緩沖蛋白陳水見B.1第一種選擇性增菌液：RVS肉湯見B.2第二種選擇性增菌液：MKTT舷）湯見B.3固體選擇性平板培養(yǎng)基第一種培養(yǎng)基：木糖賴氨酸去氧膽酸鹽瓊脂（XLD脂）見B.4第二種培養(yǎng)基第二種培養(yǎng)基

9、的選擇是留給檢測實驗室自定。在它的準備使用時應(yīng)準備按廠家說明書準確執(zhí)行。營養(yǎng)瓊脂見B.5三糖/鐵瓊脂（TSI瓊脂）見B.6尿素瓊脂（Christensen）見B.7L-賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基見B.8B-半乳糖甘酶檢測試劑（或依照廠商說明書使用的比色盤）見B.9V-P反應(yīng)試劑見B.10呷咪反應(yīng)試劑見B.11半固體營養(yǎng)瓊脂見B.125.2.13生理鹽水溶液見B.135.3血清含有一種或多種O抗原的多價血清型可由商品化獲得，也就是包含一個或更多個O群抗血清（稱單價或多價抗O血清），抗Vi血清和含有一個或多個H因子的抗血清（稱單價或多價抗菌素H血清）。應(yīng)確保所用的抗血清足以檢測所有的沙門氏菌血清型。6設(shè)備

10、和玻璃器皿如果操作規(guī)范，對于可重復(fù)使用的玻璃器皿，重復(fù)使用是可以接受的。通常或特殊情況下微生物實驗室設(shè)備（見ISO7218）如下：干滅菌（烘箱）或濕滅菌（高壓滅菌器）設(shè)備見ISO7218干燥柜或烘箱，通過對流通風，能在37c土1C和55c土1C之間調(diào)節(jié)溫度。培養(yǎng)箱，能調(diào)節(jié)溫度至351或371C。水浴，能調(diào)節(jié)溫度至41.5C1C,或孵育，能調(diào)節(jié)溫度至41.5C1CO水浴，能在44C-47c問調(diào)節(jié)溫度。水浴，能調(diào)節(jié)溫度至37C1C。由于沙門氏菌的低傳染性，推薦使用含有抗菌劑的水浴鍋（6.4、6.5和6.6）滅菌環(huán)，直徑約為3mn口斤是0TSI瓊脂（5.2.6）先在TSL瓊脂斜面上劃線，再于底層穿刺

11、。在37C土1C孵育24h3h。在培養(yǎng)基上顏色變化的解釋如下：a）底部黃色葡萄糖陽性（葡萄糖被利用）紅色或未變葡萄糖陰性（葡萄糖未被利用）黑色硫化氫形成氣泡或裂縫葡萄糖產(chǎn)氣b）斜面黃色乳糖和/或蔗糖陽性（乳糖和/或蔗糖被利用）紅色或不變色乳糖和/或蔗糖陰性（乳糖和蔗糖均不被利用）典型的沙門氏菌培養(yǎng)物顯示堿性（紅色）斜面和酸性（黃色）底部，伴隨著產(chǎn)氣（氣泡）和（約90%情況下）硫化氫產(chǎn)生（瓊脂變黑）（9.5.3.8）。當分離到乳糖陽性的沙門氏菌時，TSI的斜面是黃色的。因此，沙門氏菌培養(yǎng)物的初步確認并不能僅僅根據(jù)TSI瓊脂試驗的結(jié)果。尿素瓊脂（5.2.7）在瓊脂斜面上劃線。在371C孵育24h3

12、h,間隔一定時間檢查。如果反應(yīng)是陽性，尿素裂解釋放氨，其顏色由酚紅變成玫瑰紅，最后變成深櫻紅色。反應(yīng)通常在2h-4h后可見。L-賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基（5.2.8）接種于液體培養(yǎng)基表面以下，在37c1C孵育24h土3h0培養(yǎng)后出現(xiàn)混濁及出現(xiàn)紫色表明為陽性反應(yīng)。黃色表明陰性反應(yīng)。B-牛乳糖試驗取滿環(huán)可疑菌落放于含有0.25ml生理鹽水的試管中。加1滴甲笨并搖勻。把試管放入37c水?。?.6）,保持幾分鐘（約5分鐘）。加0.25ml檢測B-牛乳糖的試劑，混勻。再將試管放入37c水浴，保持24h3h,間隔一定時間檢查試管。黃色表明為陽性反應(yīng)。反應(yīng)通常在20分鐘后可見。如果用準備好的紙片（5.2.9）,則

13、按照生產(chǎn)廠商的說明書操作。V-P反應(yīng)培養(yǎng)基取滿環(huán)可疑菌落放于含有3mlVP培養(yǎng)基的滅菌試管中。在371C孵育24h3h。孵育后，加入2滴肌氨酸溶液，3滴1-蔡酚-乙醇液，隨后加入2滴氫氧化鉀溶液；每種試劑加完后要搖勻。15分鐘內(nèi)顏色由粉紅變?yōu)轷r紅表明陽性反應(yīng)。呷咪反應(yīng)培養(yǎng)基將可疑菌落接種于含有5ml的胰蛋白陳/色氨酸培養(yǎng)基的試管中。在371C孵育24h3h0孵育后，加1mlKovacs試齊上出現(xiàn)紅色環(huán)表明陽性反應(yīng)。黃褐色環(huán)表明陰性反應(yīng)。生化試驗的解釋常見沙門氏菌出現(xiàn)的反應(yīng)結(jié)果見表1。血清學(xué)確認和血清型概要在消除自凝現(xiàn)象后，用適當?shù)难逋ㄟ^玻片凝集試驗對純菌落（9.5.2）檢測沙門氏菌O抗原、V

14、i抗原和H抗原的存在。如果與以下描述有差異的話，則按照產(chǎn)品說明書使用抗血清。自凝現(xiàn)象的消除放一滴生理鹽水（5.2.13）于仔細清潔過的玻片上。用接種環(huán)挑取部分被測菌落并將水滴打散，以獲得均一混濁的懸浮液。注將部分被測菌在一滴水打散，然后用一滴生理鹽水（5.2.13）與它混勻，這也是可能的。輕輕搖動玻片30s-60s。在暗背景下觀察結(jié)果，用放大鏡更好。如果細菌凝集成或多或少的明顯塊狀，則可認為是自凝集，那么按照下列方法進行沙門氏菌的抗原測定是不可行的。O-抗原測定用一個無自凝集的純菌落，用一滴抗。血清（5.3）代替生理鹽水（5.2.13）,按9.5.4.2步驟操作。如果出現(xiàn)凝集，則認為該反應(yīng)為陽

15、性。用多價和單位血清接連凝集。Vi-抗原測定按9.5.4.2步驟操作，但用一滴抗Vi血清代替生理鹽水。如果出現(xiàn)凝集，則認為該反應(yīng)為陽性。試驗,沙門氏菌屬（9.5.329.5.7）傷寒沙門氏菌A型副傷寒沙門氏菌B型副傷寒沙門氏菌C型副傷寒沙門氏菌其它菌屬反應(yīng)%反應(yīng)%b反應(yīng)%反應(yīng)%c反應(yīng)%bTSI 葡萄糖產(chǎn)酸+100+100+100TSI 葡萄糖產(chǎn)氣d-0+100+92TSI 乳糖產(chǎn)酸-2-100-1TSI 庶糖產(chǎn)酸-0-0-1TSI 硫化氫產(chǎn)生+97-10+92尿素水解-0-0-1賴氨酸脫竣酶+98-0+950-牛乳糖反應(yīng)-0-0-2eV-P 反應(yīng)-0-0-0口引噪反應(yīng)-0-0-1a 來源于參考

16、資料5b 這些百分率表明并不是所有分離到的沙門氏菌血清型都會顯示出+或-的反應(yīng)結(jié)果。在食物中毒不同部位間或食物中毒里面所分離出的沙門氏菌血清型，其百分率是可以變化的。c 這些百分率不能從現(xiàn)有的文獻中獲得。d 傷寒沙門氏菌不產(chǎn)氣。e 亞利桑那亞型腸炎沙門氏菌為乳糖陽性或陰性反應(yīng)，但通常 0-牛乳糖為陽性反應(yīng)。為便于這些菌屬的研究，執(zhí)行補充試驗可能很有用處。表1生化試驗的解釋H-抗原測定將純的無自凝集的菌落接種于半固體營養(yǎng)瓊脂。在37c1C孵育24h3h用此培養(yǎng)物來檢測H-抗原，按9.5.4.2步驟操作，但用一滴抗H血清代替生理鹽水。如果出現(xiàn)凝集，則認為該反應(yīng)為陽性。生化和血清學(xué)反應(yīng)的解釋表2給出

17、的是所用菌落（9.5.2）完成確認試驗（9.5.3和9.5.4）的解釋。表2確認試驗的解釋生化反應(yīng)自凝集血清學(xué)反應(yīng)解釋典型的無O-,Vi-或H-抗原陽性考慮是沙門氏菌典型的無所有反應(yīng)為陰性典型的有未做（見9.5.4.2）可能是沙門氏菌不典型反應(yīng)無/有O-,Vi-或H-抗原陽性不典型反應(yīng)無/有所有反應(yīng)為陰性排除沙門氏菌最后確認被考慮為沙門氏菌，或可能是沙門氏菌（見表2）的菌落，應(yīng)送公認的沙門氏菌參比中心做最后的血清型確認。送確認時應(yīng)同時附上關(guān)于此菌的所有盡可能多的信息，以及是一次爆發(fā)流行還是在食物中10結(jié)果表達與解釋的結(jié)果相一致，揭示Xg或Xml測試樣品中是否存在沙門氏菌。多實驗室間的試驗所獲得

18、的精密數(shù)據(jù)見附錄C。11測試報告測試報告應(yīng)詳細說明：制樣方法，如果知道的話；試驗過程中任何增菌液或孵育條件的偏離；所有非本國際標準指定的操作條件，或者被認為可選擇的、和可能影響結(jié)果的任何事件的細節(jié)；得到的結(jié)果；測試報告也應(yīng)該聲明得到的陽性結(jié)果是僅用了劃線培養(yǎng)基（5.2.4）而不是本國際標準指定的方法。12質(zhì)量保證為檢查實驗室用本國際標準描述的方法和培養(yǎng)基來檢測沙門氏菌的能力，提出參考樣品加入含前增菌液的質(zhì)控瓶中。對質(zhì)控瓶的檢測過程與測試樣品培養(yǎng)相一致。附錄A（標準化）檢測程序圖室溫下緩沖蛋白月東水37c士1C孵育（9.2）18h2h在溫度下的蛋白月東水緩沖溶液前增菌選擇性增菌0.1ml培養(yǎng)物+

19、10mlRVS肉湯（9.3.1）41.5C土1C孵育24h士3h1ml培養(yǎng)物+10mlMKTTn肉湯（9.3.1）37C士1C孵育24h3hXLD培養(yǎng)基和選擇第二種瓊脂（9.4.1）37C士1C孵育24h3h劃平板從每塊平板上檢測一個特征菌落，如果陰性，檢測所有明顯的菌落（9.5.2）營養(yǎng)瓊脂，37C1C孵育24h3h（9.5.2）確認生化確認（9.5.3）血清學(xué)確認（9.5.4）結(jié)果表示（條款10）（標準化）培養(yǎng)基和試劑的組織和制備B.1緩沖蛋白月東水B.1.1成份酷蛋白消化酶10.0gNaCl5.0gNa2HPO4?12H2O9.0gKH2PO41.5g水1000mlB.1.2制備將上述成

20、分溶解于水，如需要可以加熱。如需要，調(diào)節(jié)pH值，以便在消毒后25c下pH值為7.00.2。分裝培養(yǎng)基于適當容量的燒瓶中，以便滿足實驗的需要。置于高壓滅菌鍋中121c滅菌15分鐘。B.2RVS肉湯B.2.1溶齊1JAB.2.1.1成份大豆消化酶5.0gNaCl8.0gKH2PO41.4gK2HPO40.2g水1000mlB.2.1.2制備將上述成分溶解于水，如需要可以加熱到70c左右。溶液在完全RVS培養(yǎng)基制備時應(yīng)已經(jīng)準備就緒。B.2.2溶劑BB.2.2.1成份MgCl2?12H2O水B.2.2.2制備將氯化鎂溶于水中。由于氯化鎂容易吸濕，依據(jù)相關(guān)公式，可取整個的MgCl.6H2O溶解于新開的容

21、器內(nèi)250gMgCl.6H2O加入625ml的水，得到一個總體積為788ml的溶液，MgCl.6H2O度約為31.7g/100ml。B.2.3溶齊1JCB.2.3.1成份400.0g1000ml。例如,的重量濃徹底混勻培養(yǎng)基該基礎(chǔ)培養(yǎng)基于B.3.2口引喋溶液B.3.2.1成份碘碘化鉀(KI)水B.3.2.2制備孔雀綠草酸鹽水0.4g100mlB.2.3.2制備將孔雀綠草酸鹽溶于水中。溶液置于棕色瓶中，室溫保存至少8個月。B.2.4完全培養(yǎng)基成份溶液A(B.2.1)1000ml溶液B(B.2.2)100ml溶液C(B.2.3)10ml制備加入1000ml溶液A、100ml溶液B、10ml溶液C。

22、如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后pH值為5.20.2。使用前，用10ml量分裝試管。置高壓滅菌鍋中115c滅菌15分鐘。已配好的培養(yǎng)基于3C2C保存。隔天使用該培養(yǎng)基。注最終培養(yǎng)基成分是：大豆消化酶，4.5g/l;氯化鈉，7.2g/l;磷酸二氫鉀(KH2PO4+K2HPO4),1.44g/l;MgCl2,13.4g/l或MgCl212H2O28.6g/l;孔雀綠草酸鹽，0.036g/l。B.3MKTTn肉湯7基礎(chǔ)培養(yǎng)基B.3.1.1成份肉浸膏酷蛋白消化酶NaClCaCO3Na2s2O3?12H2O4.3g8.6g2.6g38.7g47.8g細菌學(xué)使用的牛膽汁亮綠水47.8g9.6g1000mlB

23、.3.1.2制備將脫水的基礎(chǔ)成份或基礎(chǔ)完全培養(yǎng)基溶解于水中，并煮沸5分鐘。如需要，調(diào)節(jié)pH,使其25c時值為8.20.2。3c2C可保存4周。20.0g25.0g100ml將碘化鉀完全溶于10ml水中，再加入碘，然后加入100ml水稀釋。不需加熱。在室溫下將配制好的溶液置于密閉容器，暗處保存。新生霉素溶液成份新生霉素鈉鹽水制備將新生霉素鈉鹽溶于水中，過濾滅菌。32c保存4周以上。完全培養(yǎng)基成份基礎(chǔ)培養(yǎng)基（B.3.1）1000ml碘-化鉀溶液（B.3.2）20ml新生霉素溶液（B.3.35ml制備無菌條件下，將5ml新生霉素溶液（B.3.3）加入到1000ml基礎(chǔ)培養(yǎng)（B.3.1）中。混勻,然后

24、加入20ml碘-碘化鉀溶液（B.3.2）?；靹颉Ｔ跓o菌條件下，按實驗需要量將培養(yǎng)基分裝于滅菌好的燒瓶中。完全培養(yǎng)基應(yīng)隔天使用。木糖賴氨酸去氧膽酸鹽（XLD）瓊脂7基礎(chǔ)培養(yǎng)基成份酵母浸粉3.0gNaCl5.0g木糖3.75g孚L糖7.5g蔗糖7.5gL-鹽酸賴氨酸5.0gNa2SO36.8g檸檬酸鐵（出）俊0.8g苯酚紅0.08g脫氧膽酸鈉1.0g瓊脂9g-18g1）水1000ml制備將脫水的基礎(chǔ)成份或基礎(chǔ)完全培養(yǎng)基溶解于水中，加熱，不停地攪拌，直至培養(yǎng)基開始沸騰。避免溫度過高。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后25c時pH值為7.40.2。將此培養(yǎng)基適量倒入燒瓶中。加熱并不斷攪拌，直到培養(yǎng)基沸騰，

25、瓊脂溶解。不要溫度過高。1）依靠瓊脂的凝膠強度。瓊脂板的制備0.04g5ml立即從44C-47c的水?。?.5）取出，攪拌并燒平板。直到凝固。使用前，在35C到55C的烘箱里小心干燥瓊脂板，直到瓊脂表面干燥。（若把蓋子拿掉或瓊脂面朝下效果更好）。燒好的平板在3C2C保存5天以上。營養(yǎng)瓊脂成份肉浸膏3.0g蛋白陳5.0g瓊脂9g-18g1）水1000ml制備將相應(yīng)組份或脫水完全培養(yǎng)基溶于水，如需要可加熱。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后25c時pH值為7.00.2。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到適當容量的試管或瓶中。高壓滅菌鍋（6.1）125c滅菌15分鐘。營養(yǎng)瓊脂板的制備將約15ml融化的培養(yǎng)基移到滅菌皮氏培養(yǎng)

26、皿中，按B4.2進行操作。三糖鐵瓊脂（TSI瓊脂）成份肉浸膏3.0g酵母浸液3.0g蛋白月東20.0gNaCl5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g檸檬酸鐵（出）0.3gNa2SO30.3g苯酚紅0.024g瓊脂9g-18g1)水1000ml制備將相應(yīng)組份或脫水完全培養(yǎng)基溶于水，如需要可加熱。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌在25c時pH值為7.40.2。將10ml培養(yǎng)基分裝于試管或平板中。高壓滅菌鍋（6.1）121c滅菌15分鐘。置于一個傾斜的位置，使底部的深度2.5cm到約5cmo尿素瓊脂（Christensen）基礎(chǔ)培養(yǎng)基成份蛋白月東1.0g葡萄糖1.0gNaCl5.0gKH2P

27、O42.0g苯酚紅0.012g瓊脂9g-18g1)水1000ml制備將相應(yīng)組份或脫水完全培養(yǎng)基溶于水，如需要可加熱。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌在25c時pH值為6.80.2。高壓滅菌鍋（6.1）121c滅菌15分鐘。尿素溶液成份尿素400g水，最后定容1000ml將尿素溶于水中，過濾滅菌并確認無菌。見ISO7218:1996,7.3.2。完全培養(yǎng)基成份基礎(chǔ)培養(yǎng)基（B.7.1）950ml尿素溶液（B.7.2）50ml在無菌條件下，將尿素溶液加入到先前融化并已冷卻到44C-47C的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。將10ml完全培養(yǎng)基分裝于滅菌管內(nèi)。要求傾斜放置。L-賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基成份L-一鹽酸賴氨酸5.0g酵

28、母浸液3.0g葡萄糖1.0g澳甲酚紫0.015g水1000ml制備將上述成分溶于水中，需要時可加熱。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后25c時pH值為6.80.2。將2ml-5ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到具螺旋帽的精密培養(yǎng)管（6.9）中。高壓滅菌鍋（6.1）121c滅菌15分鐘。3-半乳糖甘酶檢測試劑緩沖溶液成份制備將NaH2PO4溶于約450ml水的容量瓶中。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.00.2（25C）。加水至50ml。ONPG溶液成份“-硝基苯基-aD-口比喃半乳糖甘（ONPG）0.08g水15ml制備在50c左右將ONP箭于水中。冷卻溶液。完全培養(yǎng)基成份緩沖溶液（B.9.1）5mlONPG溶液（B.

29、9.2）15ml制備將緩沖溶液加入到ONPG溶液中。V-P反應(yīng)試劑VP培養(yǎng)基成份蛋白月東7.0g葡萄糖5.0gK2HPO45.0g水1000mlB.10.1.2制備將上述成分溶于水中，如需要可加熱。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后25c時pH值為6.90.2。將3ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管中（6.9）。高壓滅菌鍋（6.1）121c滅菌15分鐘。B.10.2肌氨酸溶液（N-氨基肌氨酸）B.10.2.1成份B.10.2.2制備將肌氨酸一水化物溶于水中。B.10.31-奈酚乙醇溶液B.10.3.1成份1-泰酚6g96%乙醇（體積比）100mlB.10.3.2制備將1-奈酚溶于乙醇溶液。B.10.4氫氧化鉀溶

30、液B.10.4.1成份氫氧化鉀40g水100mlB.10.4.2制備將氫氧化鉀溶于水中?？谝┓磻?yīng)試劑胰蛋白月東/色氨酸培養(yǎng)基成份胰蛋白月東10gNaCl5gDL-色氨酸1g水1000ml制備將上述成分溶于沸騰的水中。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后25c時pH值為7.50.2。每管加5ml培養(yǎng)基，進行分裝。高壓滅菌鍋（6.1）121c滅菌15分鐘。Kovacs試劑成份4-二甲氨基苯甲醛5g鹽酸，p=1.18g/ml1.19g/ml25ml2-甲基正丁醛-2-ol75mlB.11.2.2制備混合上述成分。B.12半固體營養(yǎng)瓊脂B.12.1成份肉浸膏3.0g蛋白月東5.0g瓊脂4g9g1)水100

31、0mlB.12.2制備將上述成分溶于水中，需要時可加熱。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后25c時pH值為7.00.2。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到適量的燒瓶中。高壓滅菌鍋（6.1）121c滅菌15分鐘。B.12.3瓊脂板的制備B.13生理鹽水溶液B.13.1成份8.5g1000mlB.13.2制備將氯化鈉溶于水中。如需要，調(diào)節(jié)pH,以便在滅菌后25c時pH值為7.00.2。分裝上述溶液于燒瓶或試管 （6.9）中， 使得它們滅菌后的體積為高壓滅菌鍋 （6.1）121c滅菌15分鐘。NaCl水90ml-100ml。（非標準化）多個實驗室研究結(jié)果2000年，在歐洲計劃SMTCT9620986的框架下，歐洲AFSSA

32、Ploufragan和美國生化控制系統(tǒng)組織了一次國際協(xié)作的測試。這次測試包含了歐洲9個國家的11個實驗室和美國的10個實驗室，選用新鮮干酪凝塊干酪凝塊、干蛋粉、生禽肉和一個參考物質(zhì)進行。每測試食品樣本含有兩個不同污染水平，并有一個陰性質(zhì)控品。從表C.1到C.4中，顯示出從這些協(xié)作中得到每種類型樣品的工作特性的價值。僅以清晰識別技術(shù)原因 （偏離協(xié)議） 為基礎(chǔ)， 仔細分析， 一些實驗室所得數(shù)據(jù)被排除在外。表C.1新鮮干酪凝塊樣本得到的數(shù)據(jù)分析結(jié)果新鮮干酪凝塊（空白）新鮮干酪凝塊（低水平污染）新鮮干酪凝塊（高水平污染）反饋結(jié)果的實驗室數(shù)232323每個實驗室的樣本數(shù)555拒絕接受的實驗室數(shù)222排隊

33、后留下的實驗室數(shù)212121接受樣本數(shù)105105105準確性（特異性），100準確性（敏感性）74.383.8一B性，10083.895.2和諧性，10060.571.7表C.2干蛋粉樣本得到的數(shù)據(jù)分析結(jié)果新鮮干酪凝塊（空白）新鮮干酪凝塊（低水平污染）新鮮干酪凝塊（高水平污染）反饋結(jié)果的實驗室數(shù)262626每個實驗室的樣本數(shù)555拒絕接受的實驗室數(shù)555排隊后留下的實驗室數(shù)212121接受樣本數(shù)105105105準確性（特異性），100準確性（敏感性）98.199一B性，10096.298.1和諧性，10096.298.1表C.2生禽肉樣本得到的數(shù)據(jù)分析結(jié)果新鮮干酪凝塊（空白）新鮮干酪凝塊（

34、低水平污染）新鮮干酪凝塊（高水平污染）反饋結(jié)果的實驗室數(shù)252525每個實驗室的樣本數(shù)555拒絕接受的實驗室數(shù)555排隊后留下的實驗室數(shù)202020接受樣本數(shù)10099100準確性（特異性），%100準確性（敏感性）98100一B性，%10096.9100和諧性，%10096100表C.2參考物質(zhì)得到的數(shù)據(jù)分析結(jié)果參考物質(zhì)（每瓶含5cfu的腸炎沙門氏菌）反饋結(jié)果的實驗室數(shù)26每個實驗室的樣本數(shù)5拒絕接受的實驗室數(shù)1排隊后留下的實驗室數(shù)25接受樣本數(shù)125準確性（特異性），%準確性（敏感性）94.4一B性，%88.8和諧性，%89.1參考書目ISO6887-2,MicrobiologyoffoodandanimalfeedingstuffsPreparationoftestsampies,initialsuspensionanddecimaldilutionsformicrobiologicalexaminationPart