PEG沉淀法病毒提純方法

1、1. Virusessuchasbaculoviruscanbeconcentratedbypolyethyleneglycolprecipitation.2. AdjustthepHofthevirus-containingsupernatantto7.2-7.5.Polyethyleneglycol(PEG,MW6,000)isaddedtoafinalconcentrationof8%(w/v).3. Stirat4Cfor2hours.4. Centrifugeat10,000 xgfor2hours.5. Resuspendthepelletinasmallvolumeofappro

2、priatebuffer(e.g.,RNase-freeddH2forvirusRNAprep).沉淀法-病毒提純方法主要是從稀的懸浮液中濃縮病毒，有中性鹽沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、皂土法和魚精蛋白沉淀法等。1 .中性鹽沉淀法：病毒一般在45%A上飽和度的硫酸錢溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的組織培養(yǎng)液中加入等體積的飽和硫酸錢，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、雞新城疫病毒等。2.聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇（PEG）為水溶性非離子型聚合物，具有各種不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量為20006000的PEG將PEG配成50%右的溶液，或直接將

3、固體PEG加于病毒懸液中，使其達到所需濃度，通常在4c攪拌過夜，然后離心使病毒沉淀。Tanncock（1985年）成功地用PEG縮了禽腦脊髓炎病毒。3.有機溶劑沉淀法：甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提純病毒，但乙醍、氯仿等脂溶劑對于具有脂質(zhì)囊膜的病毒具有破壞和滅活作用，故不適于這類病毒的濃縮提純。4.等電點沉淀法：病毒粒子在等電點時，所攜帶的正電荷與負電荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而發(fā)生沉淀。多數(shù)病毒的等電點在pH4.55.5之間，因此在pH36范圍內(nèi)均可沉淀，由于一部分細胞成份在等電點時亦發(fā)生沉淀，此法效果不太理想，但從感染的組織培養(yǎng)液中濃縮病毒，可以獲得較好結(jié)果。應用酸性范

4、圍的等電點沉淀或分級沉淀病毒時，必須注意pH對病毒活性的影響及病毒粒子電荷與組織蛋白電荷的差異。5.皂土法：Girin（1989年）應用皂土在酸性條件下（pH44.5）吸附輪狀病毒SA-11,再在堿性條件下（pH8.5）,又使其洗脫下來，從而達到純化目的。6.魚精蛋白沉淀法：魚精蛋白為堿性蛋白，具有攜帶其它蛋白質(zhì)共沉淀的作用，能和直徑大于50nm的病毒共同沉淀而不影響病毒的感染力。當向這種沉淀物加入1mol/LNaCl時，病毒又重新釋放到懸液中，而魚精蛋白仍然沉淀。直徑小于50nm的小型病毒則不與魚精蛋白共同沉淀。因此，可利用魚精蛋白去除病毒材料中直徑大于50nm的異種蛋白質(zhì)。聚乙二醇HOCH

5、2（CH2OCH2）nCH2O留14）（PolyethyleneGlycol簡寫為PEG）,它的親水性強，溶于水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的PEG。PEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關，同時還受離子強度、溶液pH和溫度等因素的影響。在一定的pH值下，鹽濃度越高，所需PEG的濃度越低，溶液的pH越接近目的物的等電點，沉淀所需PEG的濃度越低。在一定范圍內(nèi)，高分子量和高濃度的PEG沉淀的效率高。以上這些現(xiàn)象的理論解釋還都僅僅是假設，未得到充分的證實，其解釋主要有：認為沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。由

6、于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復合物，在重力作用下形成沉淀析出。通過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。有機聚合物沉淀的優(yōu)點是：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性；沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生物大分子；沉淀后有機聚合物容易去除。水溶性非離子型聚合物沉淀法常用的聚合物為聚乙二醇（PEG及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白質(zhì)的機制尚不清楚，大致有如下解釋：聚合物與蛋白質(zhì)形成共沉物；聚合物與蛋白質(zhì)之間發(fā)生水的重分配；聚合物與蛋白質(zhì)形成復合物。此法受許多因素影響，主要是pH、離子強度、蛋白質(zhì)濃度和

7、PEG的分子量等。分子量為2000,6000的PEG皆適宜于做蛋白沉淀用。如若使用得當，效果甚為滿意。一般認為，PEG濃度在3%4%時沉淀免疫復合物，6%7%可沉淀IgM,8%12%可沉淀IgG,12%15%可沉淀其他球蛋白，25%可沉淀白蛋白。最突出的應用是用3%4%的PEG沉淀免疫復合物，未結(jié)合的抗原和抗體留在溶液中。按此原理設計了快速測定法和循環(huán)免疫復合物測定法從網(wǎng)上搜索到得關于PEG沉淀提純病毒的方法，先匯總至此貼，希望大家支持本版1、用超聲波或凍融的方法使細胞破碎釋放出病毒；2、慢慢攪動并加入NaCl終濃度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10%PEG。般使用的是PEG

8、6000就可以了。如果對樣品的純度不是嚴格要求的話，可以建議使用Millpore公司的離心濃縮柱，Amicon系列的可以一次濃縮15ml樣品。）；3、4c過夜或放置一段時間；4、8000/min離心30分鐘，收集病毒沉淀；5、將病毒沉淀加入適量的pbs中，4c過夜；6、10000r/min離心1小時，沉淀即為濃縮的病毒。還可以用梯度離心或其他方法進一步純化。PEGM淀法提純病毒1、用超聲波或凍融的方法使細胞破碎釋放出病毒；2、慢慢攪動并加入NaCl終濃度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10%PEG（一般使用的是PEG6000就可以了。如果對樣品的純度不是嚴格要求的話，可以建議使

9、用Millpore公司的離心濃縮柱，Amicon系列的可以一次濃縮15ml樣品。）；3、4C過夜或放置一段時間；4、8000/min離心30分鐘，收集病毒沉淀；5、將病毒沉淀加入適量的pbs中，4c過夜；6、10000r/min離心1小時，沉淀即為濃縮的病毒。還可以用梯度離心或其他方法進一步純化。Concentratingvirus(PEG6000)1. Virusessuchasbaculoviruscanbeconcentratedbypolyethyleneglycolprecipitation.2. AdjustthepHofthevirus-containingsupernatant

10、to7.2-7.5.Polyethyleneglycol(PEG,MW6,000)isaddedtoafinalconcentrationof8%(w/v).3. Stirat4Cfor2hours.4. Centrifugeat10,000 xgfor2hours.5. Resuspendthepelletinasmallvolumeofappropriatebuffer(e.g.,RNase-freeddH2forvirusRNAprep).PEG-it?慢病毒濃縮試劑價格：3802.5說明：歡迎詢價詳談貨號：LV810A-1PEG-it?慢病毒濃縮試劑原理PE加高分子聚合物，具有高親水性

11、，在溶液中會吸收大量水分，減少病毒之間的距離，使病毒與病毒能夠很容易的聚合在一起，病毒的相對濃度提高，達到沉淀濃縮的目的。PEG-it?中還含有特定的（SBI專屬的）緩沖液，它能夠保持病毒的活性。少量殘留的PEG-it?還會提高感染效率,使病毒更穩(wěn)定。圖1使用簡便快捷只需將5倍的PEG-it?溶液與包含病毒顆粒的細胞培養(yǎng)基混合離心30分鐘，即可得到10-100倍的病毒濃縮液特點快捷：全程只需30min高效：能使病毒顆粒濃縮10-100倍安全：對所有靶細胞，包括胚胎干細胞是無毒的使用方便：無需使用特別的儀器，避免了昂貴的超高速離心機的使用，只需普通離心機，低速離心即可無殘留：沒有細胞殘片的殘留，

12、避免對細胞的毒性和免疫原性提高轉(zhuǎn)導效率：為動物轉(zhuǎn)導提供高滴度的病毒特別適合大體積的病毒濃縮，解除了超濾管小量的限制產(chǎn)品信息貨號產(chǎn)品名稱包裝體積價格（）說明LV810A-1PEG-it?VirusPrecipitationSolution(100mLaliquot)100mL3802.5適用于400ml慢病毒細胞上清液濃縮LV825A-1PEG-it?VirusPrecipitationSolution(250mLaliquot)250mL8287.5適用于1L慢病毒細胞上清液濃縮純化病毒用終濃度10%PEb理后8000g離心，溶解于PBS這樣的方法對嗎？PEG沉淀的原理是什么啊？是這樣的，純化

13、病毒和噬菌體都可以，原理就是PEG800覺一種高度的網(wǎng)狀聚合物，很粘稠，可以把病毒沉淀下來。Catalog#ProductName+SizePriceBuyNowK904-200PEGVirusPrecipitationKit200preparations$725.00$245.00PEGVirusPrecipitationKitK904-5050preparationsPEGVirusPrecipitationKit中文名稱背景資料包裝出來的重組病毒常常含量很少，因此通常需要濃縮之后才能進行儲存或其它應用。另外，在病毒包裝過程中，可能會產(chǎn)生有毒的蛋白或生物分子雜質(zhì)。因此需種快速、簡單而便宜的

14、方法來濃縮病毒，同時去除雜質(zhì)。產(chǎn)品描述BioVision的PEG病毒沉淀試劑盒提供了一種簡單方便省時的方法來濃縮病毒，無需超速離心。本試劑盒可用于小實驗樣品處理或者大規(guī)模高產(chǎn)出、高生物量病毒制備。本試劑盒可利用細胞培養(yǎng)液或者環(huán)境樣品濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒、慢病毒、噬菌體等。濃縮倍數(shù)可達100倍以上。試劑盒供應商Biovision產(chǎn)品貨號K904-200產(chǎn)品報價11600/200次分析PEGW毒沉淀試劑盒（200次）中國 L 種優(yōu)化的重懸溶液可最大化地進行病毒復蘇，根據(jù)病毒類型和來源，復蘇比例在不等。整個過程都使用無毒試劑，濃縮的病毒可用于感染實驗、DNRNA屯化等。40-100%產(chǎn)品特點1、

15、一種快速簡單便宜的方法濃縮病毒去除雜質(zhì)；2、簡單方便省時的方法濃縮病毒，3、病毒可濃縮100以上；4、整個過程都使用無毒試劑。無需超速離心；保存建議請在接收到該Biovision品牌的PEGW毒沉淀試劑盒（200次）產(chǎn)品后，置于-20C保存。PEGVirusPrecipitationKit中文名稱PEGW毒沉淀試劑盒（50次）供應商Biovision產(chǎn)品貨號K904-50產(chǎn)品報價3920/50次分析超速離心法-病毒提純方法錄入時間:2009-6-269:30:33來源：青島海博病毒粒子經(jīng)過初步濃縮之后，要進一步純化，通常采用超速離心法，它是分離提純不同大小的病毒的有效方法之一。在應用超速離心法

16、沉淀病毒時，必須了解所用離心機的離心力。離心機由于轉(zhuǎn)頭的回轉(zhuǎn)產(chǎn)生了強大的離心力，這種離心力是隨轉(zhuǎn)頭的大小和離心管至轉(zhuǎn)軸中心的距離而變化的。高速和超速離心機的離心條件，有的以每分鐘速度（r/min）表示，有的則以離心力重力加速度g（980cm/S2）為單位來表示。離心沉淀時，沉降速度與離心力有關。當運轉(zhuǎn)角速度為co,運轉(zhuǎn)半徑為R時，則：JZ離心力群 33=（2兀r/min）/60,JZg=SX（4nr/min23600X9B0SX）XHT5”53JZ圖13-2=角轉(zhuǎn)頭的橫剖面圖JZ表明從旋轉(zhuǎn)中心到離心管頂部、中部及底部的距離。HT5SS上式中，Rav為離心管中心至轉(zhuǎn)軸中心的平均距離（如圖13-2

17、）。從上式可以作出r/min、R與g三者關系的貫線圖（如圖13-3）。三者中如知其二，就可推算另一數(shù)值。如轉(zhuǎn)速超過7萬，或R為英寸時，可參閱圖13-4。HT5”圖13-3=推算轉(zhuǎn)頭離心力的貫線圖J2圖13-4=推算轉(zhuǎn)頭離心力的貫線圖由此圖可以獲得與半徑相關的相對離心力的值。將尺里在圖左側(cè)表示離心頭中的離心管距轉(zhuǎn)軸中心的距離（即旋轉(zhuǎn)半徑的標尺）上，然后使之與預選轉(zhuǎn)速（即圖右側(cè)的離心速度標尺）成一直線，在圖中央的標尺上即可讀出相對離心力之值。圖中點線表示測量一個相對離心力的例子。HT5SS離心機轉(zhuǎn)速在4000r/min左右的稱為低速 （普通） 離心機； 轉(zhuǎn)速至25 000r/min左右的 稱為高速

18、 離心機； 轉(zhuǎn)速25 000r/min以上的稱為超速離心機。高速和超速離心機裝有冷凍裝置和抽真空裝置，以保持離心腔中恒定的低溫，并減少轉(zhuǎn)頭運轉(zhuǎn)時空氣的摩擦力。超速離心機有制備和分析用兩類，最近又生產(chǎn)出制備、分析及區(qū)帶連續(xù)離心三用裝置在一起的離心機，有的還帶掃描裝置。使用超速離心機的分離提純方法有三種：（1）差速離法；（2）速度區(qū)帶離心法；（3）平衡密度梯度離心法（或等密度梯度離心法）。1 .差速離心法這是應用較早的簡單方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差別的基礎上。具體做法是將被分離的樣品交替進行低速離心與高速（或超速）離心。沉降速度差別在一個或幾個數(shù)量級的粒子，可用本法分離提取

19、。粒子大小、轉(zhuǎn)速與離心沉淀時間的關系，如圖13-5。HT5+*SSJZ圖13-5=病毒粒子大小、轉(zhuǎn)速及離心沉淀時間的關系圖HT底差速離心適用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細胞吸附釋放的病毒懸液中提純病毒。在由感染細胞或組織勻漿中提取病毒時，由于與病毒大小相近的細胞亞單位及碎片的存在，提純效果不理想。差速離心法的優(yōu)點是能迅速處理大量樣品，故常作為病毒精制的第一個階段，或者用于病毒樣品的濃縮和粗提。以差速離心法分離提純病毒時，經(jīng)常以低速（20003000r/min,2030分鐘）及中速（10000r/min,2030分鐘）去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其他較大的雜質(zhì)。然后，選擇在60分鐘

20、內(nèi)能夠沉淀80蛆上的病毒粒子的較高速度，離心12小時，使病毒沉淀。對中、大型病毒如流行性感冒病毒，在經(jīng)紅細胞吸附釋放后，于25000r/min離心60分鐘，即可達到目的。小型病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、披膜病毒，則需以3500045000r/min離心12小時。高速或超速離心沉淀物，可用研磨和超聲波振蕩等方法打碎后懸浮于緩沖液中。對于非病毒雜質(zhì)較多的樣品進行差速離心，由于病毒對沉淀物的非特異性吸附而有較多損失。2.速度區(qū)帶離心法是根據(jù)被分離物質(zhì)在強大離心力中沉降速度不同而進行的分離方法。 該法使用的介質(zhì)密度應該小于被分離物質(zhì)的密度。介質(zhì)可以為均一密度，也可以為梯度密度。當被分離的物質(zhì)沉降到與介質(zhì)密度

21、相等的區(qū)域時就不再沉降。不同分子形成不同的區(qū)帶，而稱為速度區(qū)帶。該法要求樣品濃度為頂端濃度梯度的1/10,樣品體積為離心管體積的5%常用的介質(zhì)有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒純化時，將病毒樣品溶液層加于密度梯度層的頂部，借助病毒粒子或其亞單位成分本身的浮密度差別，在離心力作用下降到密度相等的介質(zhì)層內(nèi)，最后排列成帶狀停留不動。密度較小的粒子或成分停留在上面的幾層內(nèi)，密度較大的粒子或成分沉降于下面幾層內(nèi)。應用密度梯度法，可以獲得相當純凈的病毒樣品。病毒粒子或成分的沉降速度取決于其大小、形狀及比重，也取決于離心力及懸液介質(zhì)的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分離時最常應用的材料，因其易溶于水，且

22、對核酸及蛋白質(zhì)呈化學惰性。常用的梯度范圍從5%-20%10%-60%蔗糖濃度梯度離心后，蔗糖溶液的密度以折射法測定折射率，按如下公式計算：JZp=27329Tl20-26425蔗糖溶液的折射率如表13-2。除蔗糖濃度連續(xù)梯度離心外，近來有人在兩層濃度梯度上層加病毒濃縮樣品，經(jīng)超速離心后將病毒收集于兩層界面處；也有人在單層蔗糖濃度溶液上層加病毒濃縮樣品，經(jīng)超速離心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。這兩種方法比較簡單，但濃縮提純的效果遠遠不如多層連續(xù)梯度法。3.平衡密度梯度離心法平衡密度梯度離心法是根據(jù)粒子的浮密度不同而加以分離。所謂浮密度就是物質(zhì)的質(zhì)量減去在一定介質(zhì)中所受的浮力，亦稱有效密度。J2浮密

23、度（有效密度尸m-m（p0p）力為物質(zhì)質(zhì)量，p為物質(zhì)密度，p pQ為介質(zhì)密度。常用的介質(zhì)有氯化葩（CsCl）、氯化鋤（RbCl）、硫酸葩9s2so4）、漠化鉀（KBr）、酒石酸鉀（K2c2c4H406）等無機或有機鹽。病毒離心時，病毒粒子p比介質(zhì)密度-p6 6 大,即5病毒沉淀，ppjj時則上浮。制備梯度的方法有兩種：一種是在飽和的CsCI溶液上面層加病毒樣品（容量比1：4）;另一種是將病毒樣品與CsC濃溶液均勻地混合。一般用水平轉(zhuǎn)頭，經(jīng)較長時間的超速離心，在離心管中形成CsCl的濃度梯度，并由于離心力的作用，樣品中的病毒粒子分布于相應密度的區(qū)域內(nèi)。這種方法在分析離心中是最常用的。應用本法時，

24、離心轉(zhuǎn)頭的回轉(zhuǎn)數(shù)越高，離心時間越長，越能接近平衡狀態(tài)。平衡密度梯度離心法廣泛應用于病毒和核酸的提純上。用平衡密度梯度離心法提純的動物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型腦炎病毒、狂犬病病毒和馬傳貧病毒等。有的病毒在這些無機鹽類溶液中被破壞，可加入U2%-。5%牛血清白蛋白,或用口5 5 殳3 3U%甲醛先將病毒粒子固定，然后進行平衡密度梯度離心，常能較好地回收病毒。大多數(shù)病毒的浮密度在 L 而1飛范圍內(nèi)，見表13-3。所以制備密度范圍為1。的懸浮介質(zhì)，便可滿足大多數(shù)病毒密度梯度離心的需要。用CsCl溶液進行平衡密度梯度離心時，以測定25c時CsCl溶液的折射率（n25D的方法），按照下列公式求得各

25、梯度分層液的密度：密度范圍為p=100138g/cm3時，p25=102402n2525D-126423=（式1）密度范圍為3713時,025=1。8601n25D-1I34974=（式2）n25口指各梯度分層液在25c時的折射率，p25指各梯度分層液在25c時的密度。例=以馬傳貧病毒在CsCl平衡密度梯度離心后提純于第12分段部位中，此部分CsCl溶液折射率為13510,求其密度：將所得折射率代入式1中，則應p25三1Q2402X13510-126423=11923即馬傳貧病毒浮密度約為119。例=急性傳貧馬血清中游離鐵蛋白在CsCl平衡密度梯度離心后提純于第18分段部位,此部分CsCl溶液

26、折射率為13811,求其密度：將所得折射率代入式2中，則JZp25=106801X13811-134974=15CM即鐵蛋白浮密度約為1如各種無機鹽溶液的密度與折射率的關系，一般以下列公式表示：JZp=a?n-b如果知道各種鹽類溶液的系數(shù)a和b,即可按測定折射率的方法簡單地求得其密度。由折射率計算急度時，常用溶質(zhì)的質(zhì)數(shù)a和b值及其密度的適用范圍如表13-5。4.兩種超離方法的比較速度區(qū)帶離心法和平衡密度梯度離心法各有特點，現(xiàn)將這兩種超離方法加以比較，具體見表13%nzHHir5HI表13-6=速度梯度離心法與平衡密度梯度離心法的特點HT6SSBG（!BHDFG2,WK11WK20ZQWK20Z

27、QW他度區(qū)帶離心法口平衡密度梯度離心法BHDG4原理口沉降與顆粒質(zhì)基最正比：以物質(zhì)沉降速度的不同進行分離口沉降與顆粒的密度成正比，以物質(zhì)的浮密度不同進行分離BHDG6介質(zhì)口密度小，如蔗糖、甘油、聚蔗糖，蔗糖濃度10%67V密度11328&預制梯度，不連續(xù)口密度大，如CsCLCs2so4,CsCl濃度01355,355,密度為119025,自成連續(xù)梯度BHG4離心力場強，離心速度高，使被分離物質(zhì)易沉降口稍強，速度相對低，使CsCl形成梯度，建立沉降擴散平衡BHG4離心過程樣品向離心管底沉降不論樣品起始時在什么位置，離心中樣品停留于介質(zhì)的等密度部位BHG2離心時間口較短，一般為幾小時到幾十

28、小時口較長，十幾小時到數(shù)天5.密度梯度離心法的操作程序（1）密度梯度的制備：制備密度梯度的方法有不連續(xù)的（即人工操作）和連續(xù)的（即機械操作）密度梯度兩種。不連續(xù)的或分層的密度梯度的制備不連續(xù)的密度梯度是以人工操作法制備的，在一定溫度下（一般在20c或在25C）配制一系列濃度差為5%勺梯度溶液，例如蔗糖可配制成5%10%15%20%25%30%35%40%（W/V）等溶液（用蒸儲水或適宜的緩沖液配制），用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取濃度最大的溶液注入離心管底，然后依次加入較低的各個濃度（40%-5%）,一層覆蓋著一層地層加于離心管中，注意避免產(chǎn)生氣泡。假如各層界面被沖動破壞，則應重新制備。

29、也可以將長針頭插入管底，依次從濃度低到高加入各溶液。連續(xù)的密度梯度的制備為了產(chǎn)生一個連續(xù)的密度梯度，常用梯度混合裝置來制備梯度。HT5SSJZ圖13-6=簡易的密度梯度溶液制備裝置JZA、B為盛蔗糖溶液的玻璃管。J2i活塞雙通；2攪拌棒；3活塞；4連接處；一彳聚乙烯小管HT55S梯度混合裝置如圖13-6,由A和B管組成。兩管之間用雙通活塞聯(lián)結(jié)。在活塞關閉的狀態(tài)下，向A管中加入低濃度蔗糖溶液，向B管中加入高濃度的蔗糖溶液，兩管中容量要相等。在B管出口處用一根聚乙烯小管連接到離心管。在2B管充液時，可將聚乙烯小管的流出口向上轉(zhuǎn)動，使之超過液體的水平面，從而阻止液體流出。充液后可將小管接到離心管中使

30、之貼著管壁，然后開動小攪拌器，使攪拌棒轉(zhuǎn)動，同時打開兩管間活塞。這三個操作要同時進行，以保證梯度的連續(xù)性。當梯度液體自B管流出時不允許移動離心管，待離心管中所盛的梯度溶液的體積達到需要量之后，將離心管小心地靜止于4C12小時，以平衡之?，F(xiàn)在不少“制備用超速離心機”攜帶有“密度梯度制備自動裝置”。按照這個方法制備的蔗糖濃度梯度，理論上按下式計算：J2CR力電4CBH1-V）_-b/aA管和B管的橫斷面積各為a、b,其中所含蔗糖濃度分別為CA、CB兩液開始混合以后流出Vml時流出液的濃度為CA和B管的橫斷面積一般情況下相等，故a=b,這時獲得的梯度為直線梯度。如果awb時，離心管中濃度梯度產(chǎn)生凸形

31、和凹形梯度曲線。這些濃度梯度是根據(jù)樣品和實驗目的而專門選用的。一般使用的濃度梯度范圍為20*5%40*10%或60*10播。（2）加入樣品：用如上所述注射器或微量吸管吸取懸浮于適宜緩沖液中的病毒或核酸樣品（約梯度介質(zhì)體積的1/10容量），從液面上方1mm#,緊貼著離心管壁輕輕層加于梯度介質(zhì)面上。（3）高速或超速離心：將加入樣品的離心管裝入套管內(nèi)，也可將離心管置于轉(zhuǎn)頭的套管內(nèi)，以免在裝進套管時震動液體。擰緊套管螺帽，將套管吊在水平轉(zhuǎn)頭上，置于離心機內(nèi)。梯度離心一般用高速或超速離心機。離心速度和時司，根據(jù)所分離的樣品選定。離心開始，樣品中各種粒子逐漸分離，分布于相應的密度梯度層中成為帶狀（如為透明的聚碳酸酯離心管，則可以清楚地見到帶狀分離，并拍照）。離心時間到時，使離心機自然停止，不許制動，以免破壞梯度。（4）梯度的分段收集（取樣）：在離心完了以后，為了把已分離物質(zhì)的各條帶分開，必須取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下幾種。取代法：從離心管底部穿刺或?qū)чL針頭的注射器插入離心管底，使一種稠