西地那非對(duì)高氧所致肺損傷模型新生鼠的保護(hù)作用

1、西地那非對(duì)高氧所致肺損傷模型新生鼠的保護(hù)作用【摘要】 目的：觀察西地那非對(duì)高濃度氧暴露后新生大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變的影響,并探討其機(jī)制。方法：80只足月新生SD大鼠隨機(jī)分為空氣加生理鹽水對(duì)照(A)組、空氣加西地那非(B)組、高氧加生理鹽水對(duì)照(C)組和高氧加西地那非治療(D)組4組。C、D組輸入高體積分?jǐn)?shù)氧(FiO2 0.85),B、D組每天予西地那非100mg?kg1背部皮下注射。在實(shí)驗(yàn)第14天觀察肺組織病理改變、放射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC),并且用免疫組化法測(cè)定肺組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白水平。結(jié)果：D組肺組織病理改變減輕,RAC和肺微血管數(shù)目高于C組(7.3400.620 vs 5

2、.0130.738，P0.001；3.8550.717 vs 2.3750.705，P0.001)，且B、D兩組肺組織eNOS表達(dá)明顯增加(均P0.001)。結(jié)論：西地那非對(duì)高氧所致肺損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與西地那非降低肺內(nèi)血管壓力及促進(jìn)肺微血管生成并增加eNOS的表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 西地那非； 高壓氧； 肺； 新生大鼠 氧療是兒科常用的治療措施,可提高動(dòng)脈血氧分壓,改善組織缺氧。但在肺發(fā)育不成熟的早產(chǎn)兒中,長(zhǎng)時(shí)間高濃度的氧療易造成肺損傷,甚至導(dǎo)致患兒病死率增加,其中常見(jiàn)的慢性肺部疾病支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD) 即與氧療密切

3、相關(guān)。該病以肺發(fā)育停滯為主要病理表現(xiàn)，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,治療也在探索中。西地那非為5- 磷酸二酯酶選擇性抑制劑，臨床主要用于治療勃起功能不良及中重度肺動(dòng)脈高壓。有研究表明1，在嬰幼兒肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中,西地那非能高選擇性地?cái)U(kuò)張血管,降低肺血管阻力,從而有效地降低肺動(dòng)脈壓力,增加心輸出量。由于對(duì)這些新功能的認(rèn)識(shí),臨床上對(duì)西地那非的新用途產(chǎn)生了濃厚的興趣。本實(shí)驗(yàn)予足月新生Sprague- Dawley (SD)大鼠持續(xù)吸入高濃度氧(FiO2=0.85)14d造成高氧肺損傷模型2，同時(shí)予西地那非皮下注射治療,通過(guò)觀察對(duì)比各組間肺組織形態(tài)學(xué)改變、肺放射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)、肺內(nèi)微血管計(jì)數(shù)等，

4、觀察西地那非對(duì)高氧肺損傷大鼠模型肺組織形態(tài)學(xué)的影響,并進(jìn)一步探討西地那非的作用機(jī)制。 1 材料與方法 1.1 材料 西地那非注射液由中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)研究所根據(jù)文獻(xiàn)3的方法，用西地那非片劑（批號(hào)B- 2103- 0001- 888888，輝瑞制藥有限公司）制成。小鼠抗大鼠eNOS抗體、羊抗大鼠CD31抗體購(gòu)自Santa Cruz公司,即用型SABC及DAB顯色劑購(gòu)自北京中杉生物公司。 1.2 方法 1.2.1 動(dòng)物模型制備 生后12h內(nèi)SD大鼠80只，雌雄不限（由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為空氣加生理鹽水對(duì)照組(A組)、空氣加西地那非組(B組)、高氧加生理鹽水對(duì)照組(C組)及高氧加西地

5、那非治療組(D組) 4組,每組20只。C、D組新生鼠置于玻璃氧箱,持續(xù)輸入氧氣,通過(guò)測(cè)氧儀使氧體積分?jǐn)?shù)維持在0.850.02(美國(guó)OM- 25ME型測(cè)氧儀監(jiān)測(cè))。A、B組新生鼠則置于同一室內(nèi),接受常壓空氣。高氧暴露組每天開(kāi)箱1次(更換墊料、鈉石灰、水及飼料,注射藥物,并與空氣組互換母鼠以避免母鼠因氧中毒致護(hù)理能力下降,開(kāi)箱總時(shí)間不超過(guò)1h)。維持室內(nèi)溫度2325,濕度50%70%。B、D組每天皮下注射西地那非100mg?kg-1，A、C組接受等量生理鹽水。 1.2.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集及檢測(cè)方法 標(biāo)本采集、制作 每組分別于實(shí)驗(yàn)第14天腹腔注射10%水合氯醛3ml?kg-1麻醉后摘

6、眼球放血隨機(jī)處死,將右肺上兩葉置于40g?L-1中性甲醛中固定,4過(guò)夜,石蠟包埋,制作5m組織切片,用于肺形態(tài)學(xué)觀察。 肺組織CD31和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）免疫組化檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,30g?L-1過(guò)氧化氫室溫處理10min，抗原修復(fù)，血清封閉，滴加一抗CD31 (稀釋175)或eNOS(稀釋1250),37孵育2h，滴加生物素標(biāo)記二抗,37孵育30min，加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,37孵育30min，DAB顯色。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照,PBS液代替一抗為陰性對(duì)照。采用MetaMorph圖像分析軟件,以平均積分光密度值表示eNOS陽(yáng)性染色的強(qiáng)度,其與染色程度

7、呈正相關(guān),進(jìn)行肺組織eNOS蛋白表達(dá)的半定量。 肺形態(tài)學(xué)觀察 每只動(dòng)物隨機(jī)抽取切片5張,每張切片于光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野。(1)組織切片行HE染色后光鏡觀察。(2) HE染色切片,從呼氣性細(xì)支氣管中心至遠(yuǎn)端胸膜引一垂直線(xiàn),計(jì)數(shù)該直線(xiàn)上肺泡數(shù)量即為RAC。每張切片10次計(jì)數(shù),取平均值。(3)光鏡(100)下計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的微血管數(shù)目（CD31為血管內(nèi)皮特異標(biāo)志,可反映毛細(xì)血管數(shù)目及形態(tài)的改變）。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)均以x-s表示。各組間采用One- Way ANOVA檢驗(yàn),兩兩比較采用SNK(q)檢驗(yàn)。 2 結(jié) 果 2.1 大體觀察 A、B組

8、大鼠兩肺呈粉紅色,質(zhì)軟且彈性較好；C組兩肺較蒼白,部分肺葉呈暗紅色，可見(jiàn)點(diǎn)狀出血灶；D組雙肺多數(shù)呈粉紅色，偶呈暗紅色，可見(jiàn)少量點(diǎn)狀出血灶。 2.2 光鏡觀察 A、B組肺泡毛細(xì)血管豐富,肺泡均勻,肺間隔較薄,其中B組血管增生較明顯。C組肺泡數(shù)量明顯減少,部分肺泡壁擴(kuò)張、融合,形成肺大泡；肺泡毛細(xì)血管明顯減少；肺內(nèi)散在灶狀出血和不張；肺間隔明顯增寬,其內(nèi)成纖維細(xì)胞及膠原樣物質(zhì)明顯增多；肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,部分萎陷,符合BPD的病理改變。D組病理改變較C組明顯減輕，肺泡毛細(xì)血管豐富,肺泡腔內(nèi)散在紅細(xì)胞滲出,間隔增厚不明顯,未見(jiàn)膠原沉積。見(jiàn)圖1。 AD依次為AD組 圖1 各組新生大鼠肺組織學(xué)改變 HE200

9、 2.3 各組RAC、微血管計(jì)數(shù)和eNOS蛋白表達(dá)的變化 eNOS染色陽(yáng)性信號(hào)均為棕黃色顆粒,定位于胞漿；陰性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性染色。eNOS在各組均主要分布于氣道上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,其中C、D組肺泡巨噬細(xì)胞也有陽(yáng)性表達(dá),中性粒細(xì)胞無(wú)陽(yáng)性染色。14d 時(shí)C組表達(dá)強(qiáng)度較A組明顯升高(P0.01),D組表達(dá)強(qiáng)度較C組明顯升高(P0.01)。見(jiàn)圖2、表1。表1 各組新生大鼠RAC、微血管計(jì)數(shù)和eNOS表達(dá)的變化注：F(RAC)=252.179； F(微血管計(jì)數(shù))=108.263； F(eNOS)=42.31 3 討 論 BPD是多種病因共同作用的結(jié)果，其中發(fā)育不成熟與BPD發(fā)生的相關(guān)性最大4。由于產(chǎn)前糖

10、皮質(zhì)激素、表面活性物質(zhì)的使用和機(jī)械通氣技術(shù)的改進(jìn)，導(dǎo)致BPD的表現(xiàn)和以前剛提出來(lái)時(shí)有了很大的不同，其病理特點(diǎn)已由過(guò)去嚴(yán)重的呼吸道損傷、局灶性肺過(guò)度膨脹和間質(zhì)纖維化轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑闻萁Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化和血管生長(zhǎng)異常為特征的肺發(fā)育阻滯5。因此，促進(jìn)肺微血管的生長(zhǎng)是否能夠預(yù)防和改善BPD的產(chǎn)生和發(fā)展成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。 西地那非是一種5- 磷酸二酯酶(PDE5)的選擇性抑制劑。PDE5存在于肺血管平滑肌細(xì)胞中,影響3,5- 磷酸鳥(niǎo)苷的循環(huán)代謝。國(guó)外有學(xué)者研究PDE5抑制劑在嬰幼兒肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中的作用,認(rèn)為它能高選擇性地?cái)U(kuò)張血管,降低肺血管阻力,有效地降低肺動(dòng)脈壓力,增加心輸出量,而對(duì)體循環(huán)的血流動(dòng)力學(xué)無(wú)

11、影響。在早產(chǎn)兒，吸入NO可以作為BPD預(yù)防性治療的一種措施6。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化L- 精氨酸(L-Arg)與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)生成。NOS目前已知有3種異構(gòu)體，其中eNOS為結(jié)構(gòu)型酶,主要通過(guò)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)途徑持續(xù)合成基礎(chǔ)水平的NO,在調(diào)節(jié)氣道和血管緊張性、抑制血小板聚集、對(duì)抗中性粒細(xì)胞附壁和激活等生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。高氧時(shí)肺eNOS表達(dá)的增加可能是對(duì)損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)7。 本實(shí)驗(yàn)中，足月新生鼠高氧暴露14d后出現(xiàn)肺泡間隔增寬,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺間質(zhì)細(xì)胞明顯增加。病變嚴(yán)重區(qū)正常結(jié)構(gòu)被破壞,肺泡腔明顯增大,肺泡融合，肺泡數(shù)量明顯減少，而且肺微血管密度下降。而予以西

12、地那非的治療組，肺泡發(fā)育得到改善，肺微血管的生成增多。由此證實(shí)了西地那非具有促進(jìn)肺微血管及肺泡生成的作用，對(duì)抗了高氧條件導(dǎo)致的肺微血管及肺泡的減少。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討西地那非的可能作用機(jī)制。用免疫組化方法證實(shí)予西地那非的兩組eNOS蛋白的含量都高于未用西地那非對(duì)照組，說(shuō)明西地那非有促進(jìn)eNOS產(chǎn)生的作用;另一方面，由于西地那非通過(guò)抑制磷酸二酯酶,進(jìn)而增加了cGMP的濃度,使內(nèi)源性的NO更持久地起效,不僅擴(kuò)張正常的肺血管,也使病變肺組織的血管擴(kuò)張。這可能是西地那非治療組肺泡發(fā)育得到改善的原因。 由于西地那非早已應(yīng)用于臨床,較為安全,且現(xiàn)在已經(jīng)有口服劑型，可以作為新生兒臨床治療肺損傷及預(yù)防BPD

13、的一種新的藥物，因此期待在其作用機(jī)制及用法、用量等方面有更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1SHEKERDEMIAN L S,RAVN H B,PENNYD J，et al.Intravenous sildenafil lowers pulmonary vascular resistance in a model of neonatal pulmonary hypertensionJ.Respir Crit Care Med，2002，165(8):1098- 1102.2劉雪雁,吳捷,薛辛東.高氧致新生鼠肺損傷時(shí)腎組織一氧化氮及氧自由基的變化J.中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2005,7(1):71-

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