胚胎干細胞體外分化為心肌細胞誘導(dǎo)因素的探討

1、    胚胎干細胞體外分化為心肌細胞誘導(dǎo)因素的探討        摘要目的：用胚胎干細胞(ESC)體外誘導(dǎo)分化為心肌細胞，從分子水平上研究早期心臟發(fā)育相關(guān)基因及其功能。方法：(1)胚胎干細胞的培養(yǎng)。(2)胚胎干細胞的分化培養(yǎng)。(3)被分化的心肌細胞鑒定：RNA的提?。恍呐K特異性引物的合成和RT-PCR反應(yīng)；探針標記、純化和比放射活性測定；RNA斑點雜交。結(jié)果：用最適條件培養(yǎng)液對ESC定向誘導(dǎo)分化，可使80%以上的ESC分化為心肌細胞。心肌細胞以同步的方式進行收縮。反轉(zhuǎn)錄PCR

2、和斑點雜交的結(jié)果顯示：心肌在早期發(fā)育就開始表達其特異性基因。結(jié)論：胚胎干細胞體外能誘導(dǎo)分化為心肌細胞。胎牛血清、二甲基亞砜和維甲酸的濃度及它們之間的組成不同，對ES細胞定向誘導(dǎo)為心肌細胞均有影響。最佳誘導(dǎo)條件是用2 nmol/L維甲酸、0.6%二甲基亞砜和20%胎牛血清組成的條件培養(yǎng)液。主題詞胚胎；干細胞；心?。换虮磉_中分類號Q254文獻標識碼A文章編號1000-4718(2000)05-0389-04 A study of inductive factors of embryonic stem cells differentiating into cardiac myocytes in v

3、itroLIU Lan-ying，YANG Kun，ZHU Zheng-yu, LIU Yu-chuan，YIN Wei1, MA Jian-quan, GU Jun(The Recearch Cernter of Molecular Medicine, SUN Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089, China)TANG Jian(Cardiovascular Basic Institute, Beijing University of Medical Sciences, Beijing 100089, China)

4、YU Xi-yong( Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People Hospital, Guangzhou 510080, China)AbstractAIM: To study cellular and molecular mechanisms of cardiac development associated genes expression and its function during early stage cardiomyogenesis. METHODS: (1) Mouse embryonic stem cells

5、 (ESC) line D3 culture.(2) Inductive culture of ESC differentiated into cardiac myocytes in vitro. (3) Identification of ESC-derived cardiac myocytes: RNA isolation; synthesis of specific primer and RT-PCR; Label of RT-PCR products with -32P dATP as probes, purifyed by sephadex G-50 columns, determi

6、ned the yield of DNA. RNA dot hybridization. RESULTS: 80% of ESC differentiated into cardiomyocytes by improved conditional medium. Cardiomyocytes contracted in a synchronous manner. The results of RT-PCR and RNA blot showed that cardiac genes were expressed abundantly and specifically during the ea

7、rly cardiomyogenesis. CONCLUSIONS: ESC were able to be differentiate into cardiomyocytes. Different concentrations and components of RA, DMSO and FCS affected ESC cardiomyogenesis in vitro. The optimal result obtained was from the conditional medium, a mixturce of 2 nmol/L retinoic acid (RA), 0.6% d

8、imethyl sulfoxide (DMSO) and 20% fetal calf serum (FCS).MeSHEmbryonic; Stem cell; Myocardium; Gene expression鼠胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESC)是高度未分化的多潛能干細胞，能在體外自然分化為內(nèi)臟卵黃囊、血島、神經(jīng)細胞、心肌細胞等1。ESC的建立使體外心肌發(fā)生的模型構(gòu)建成為可能，為后來者研究各種器官的發(fā)生、相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及信號傳導(dǎo)方面拓寬了領(lǐng)域。90年代初，國外學(xué)者開始將ESC分化為心肌細胞，建立了體外心肌發(fā)生模型2，使不少學(xué)者研究體外心臟形成、早期

9、心臟發(fā)育相關(guān)基因及其功能機制3,4、先天性心臟病的發(fā)病機制和干預(yù)性治療成為可能，但至今為此，ESC分化為心肌細胞的比率并不理想。在國內(nèi)這方面的研究不多，目前還未見有將ESC誘導(dǎo)分化為心肌細胞的報道。本研究綜合前人的方法，探討最佳ESC誘導(dǎo)分化為心肌細胞的因素。材料和方法一、材料(一)ESC-D3本校病理教研室提供。(二)昆明鼠本校動物中心提供。(三)主要試劑DMEM(Dulbecco?s modified Eagle?s medium),TRIZOL試劑、Sephadex G-50購于Gibco公司，-巰基乙醇購于SERVA公司，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購于BOEHRINGER MANNHEIM公司

10、，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),維甲酸(retinoic acid, RA),甲酰胺、甲醛、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone),鮭魚精DNA購于Sigma公司，胎牛血清(fetal calf serum,FCS)購于Hyclone公司。(四)引物：-actin和-MHC.-actin引物其上游序列為5-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3，下游序列為5-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3;-MHC引物其上游序列為5-ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3，下游序列為5-TCGACAATGTGTCCG

11、AGGTC-3，均由Gibco公司合成。二、方法(一)ESC-D3的培養(yǎng)5ESC需在鼠胚飼養(yǎng)層上生長才能保持未分化特性。飼養(yǎng)層是用1315 d的鼠胚成纖維細胞制成，并用10 g/mL的絲裂霉素處理1.5 h。ESC所用的培養(yǎng)液(medium)為高糖的DMEM，其內(nèi)含有0.1 mmol/L -巰基乙醇、10%的小牛血清和10%胎牛血清(FCS)。每隔2 d換1次培養(yǎng)液和1次飼養(yǎng)層。(二)條件培養(yǎng)液的制備和ESC誘導(dǎo)分化培養(yǎng)681.條件培養(yǎng)液的制備按RA、DMSO和FCS濃度不同分為3部分，每1部分以其中1種濃度變化而其它兩種不變分為10個組，每組按下列不同濃度和組成進行：(00.9)%DMSO、

12、09 nmol/L維甲酸、和(1028)%FCS溶于含有0.1 mmol/L -巰基乙醇、pH 7.4的DMEM溶液中。2.ESC懸浮培養(yǎng)ESC在除去飼養(yǎng)層的條件培養(yǎng)液中進行誘導(dǎo)分化。將ESC制成懸滴(每個懸滴含200400個ESC)置平皿蓋內(nèi)面(底面平皿內(nèi)含有少量PBS溶液)進行培養(yǎng)，兩天后形成細胞集落稱為胚胎體(embryoid bodies, EBs)，將EBs轉(zhuǎn)入直徑是100 mm平皿內(nèi)懸浮培養(yǎng)5 d(共7 d)。每組制備30個懸滴。3.EBs貼壁培養(yǎng)首先用明膠處理蓋玻片，然后置入24孔板中，再把每個EBs分別放在各個孔里的蓋玻片上，加少量培養(yǎng)液于37溫育45 h，以便EBs貼壁。貼壁

13、后加適量培養(yǎng)液(每3 d換1次)，此時“7+0 d”開始用倒置顯微鏡(25100倍)每日進行觀察，以捕獲心肌開始跳動的最初時間及連接收縮的總時間。(三)心肌細胞RNA的提取收集不同收縮時間的心肌細胞，分別提取總RNA。1×107心肌細胞加1 mL TRIZOL充分混勻，加0.2 mL的氯仿混勻、離心、取上清，加等體積的異丙醇混勻、離心，沉淀用75%的乙醇洗滌。具體過程參照TRIZOL Reagent說明書。(四)引物設(shè)計和反轉(zhuǎn)錄PCR設(shè)計-actin引物和心臟特異性-MHC引物，用它們分別對不同時間分化而來的心肌細胞RNA進行反轉(zhuǎn)錄PCR。0.2 mL薄壁管中加下列主要試劑：0.2

14、mmol/L的脫氧三磷酸核苷(dNTP)混合物，5 U RNA抑制劑，分別加4 mol/L上下游引物，1 g RNA模板，1 L酶混合物等總體積50L于55溫育40 min,95變性4 min，然后94 30 s,5830 s，6890 s，35個循環(huán)。具體過程參照TitanTM one tube RT-PCR kit說明書。(五)探針的標記、純化和比放射活性測定反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物在DNA聚合酶1 Klenow大片段作用下，用-32PdATP標記為探針，sephadex G-50層析柱純化，三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)沉淀法測其比放射活性。具體過程參照Sambr

15、ook等9的方法。(六)RNA斑點雜交收集未分化的ESC和分化不同收縮時間的心肌細胞，分別提取其總RNA，用BioRad真空抽吸儀將RNA點到Bio dyNEB尼龍膜上，室溫涼干，80烘干1 h。用上述探針分別與含有樣本RNA的尼龍膜進行雜交，雜交液含有甲酰胺、水溶性聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮等，預(yù)雜交于42雜交2 h，雜交時加入探針于42雜交16 h。然后進行洗膜和放射性自顯影10。結(jié)果一、不同濃度的RA、DMSO和FCS對ESC向心肌細胞分化的影響ESC是高度未分化的具有典型形態(tài)的多潛能干細胞(1)。在實驗過程中，設(shè)計不同條件培養(yǎng)液，分析它們對ESC定向分化的影響。按RA、DMSO和FCS濃度不

16、同分為3部分，第一部分RA濃度不同(09 nmol/L)而DMSO(0.6%)和FCS(20%)不變分為10個組，第二部分DMSO濃度不同(00.9%)而RA(2 nmol/L)和FCS(20%)不變分為10個組，第三部分FCS濃度不同(10%28%，每組相隔2%)而RA(2 nmol/L)和DMSO(0.6%)不變分為10個組。每組結(jié)果均來自于30個懸滴中分化為心肌細胞的胚胎體平均百分數(shù)(embryoid bodies with beating cardiac myocytes %)。2顯示上述3部分結(jié)果。從可見，第一部分的第1組未加RA，僅加了0.6% DMSO和20%的FCS，分化效率為

17、67%，影響不明顯；第二部分的第1組未加DMSO，僅加了2 nmol/L RA和20%的FCS，分化效率為43%，影響較大；第三部分在FCS濃度低(10%左右)的條件下加兩種誘導(dǎo)劑，其誘導(dǎo)效率僅有21%。由此可知不同濃度的RA、DMSO和FCS對ESC的分化均有影響，尤其是胎牛血清的濃度影響最大。2 nmol/L RA、0.6% DMSO和20% FCS組成的條件培養(yǎng)液對ESC誘導(dǎo)分化效果最佳。我們用此條件培養(yǎng)液將80%以上的ESC定向誘導(dǎo)為心肌細胞。心肌細胞體形狀類似半球體，在倒置顯微鏡下可觀察到一個收縮中心(3)。EBs貼壁后第1 d即“7+1 d”開始跳動，跳動頻率最高為148 beat

18、s/min，最低為53 beats/min，持續(xù)跳動的時間最長為57 d，最短為8 d。二、心肌細胞-MHC的表達以分化“7+2 d”心肌細胞的RNA為模板，用-actin和-MHC為引物進行RT-PCR擴增，大小片段分別為237 bp和688 bp(4)。RT-PCR產(chǎn)物用-32PdATP標記為特異探針(比放射性為2×107 counts.min-1.g-1 DAN)分別與分化“7+2，4，6，8，10 d”心肌細胞的總RNN進行雜交(5)。討論ESC是高度未分化的多潛能干細胞，能在體外向各個細胞系分化。我們在前人的基礎(chǔ)上進一步改進，通過用RA、DMSO和FCS的不同濃度和組成比例

19、對ESC向心肌細胞的誘導(dǎo)分化進行比較，經(jīng)過大量的實驗發(fā)現(xiàn)：FCS、RA和DMSO的濃度過低或過高或他們之間組成比例不同均能影響ESC向心肌細胞的分化，而2 nmol/L RA,0.6% DMSO和20% FCS的濃度和組成是最佳的誘導(dǎo)條件。我們用此條件培養(yǎng)液可將80%以上的ESC定向誘導(dǎo)分化為心肌細胞，并使其存活達57 d之久。    Fig 1 Morphological characterization of ESC-D3 cultivated on feeder layer(×100)1未分化的ESC-D3的形態(tài)學(xué)特征 

20、0;   Fig 2 Influence of different concentrations and components of RA, DMSO and FCS on ESC inductive differentiation2不同濃度和組成的RA，DMSO和FCS對ESC誘導(dǎo)分化的影響    Fig 3 Morphological characterization of beating aggregate of ESC-derived cardiomyocytes(×100)3心肌細胞集落的形態(tài)學(xué)特征 &#

21、160;  Fig 4 Analysis of RT-PCR by using -MHC and actin of ESC-derived cardiomyocytes (1.2% agrose gel electrophoresis)Lane 1: -MHC(688 bp); Lane 2: -actin (237 bp); Lane 3: 100 bp marker4ESC分化的心肌細胞-MHC和 actin的RT-PCR分析    Fig 5 Analysis of RNA dot hybridization of ESC-de

22、rived cardiomyocytesdot 1. negative control; dot 26. 10g each of beating cardiomyocytes RNA from “7+2，4，6，8，10d”，respectively5ESC分化的心肌細胞RNA斑點雜交分析 被誘導(dǎo)的心肌細胞的判定除常規(guī)指標外，我們還用了心臟特異性引物-MHC對不同收縮時間的心肌細胞總RNA進行RT-PCR擴增和RNA斑點雜交，發(fā)現(xiàn)該心肌細胞不僅具有正常心肌細胞的特性，而且在分化早期就高度地表達心臟特異性基因。因此，胚胎干細胞體外定向分化為心肌細胞體系的建立，為研究早期心臟發(fā)育相關(guān)基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)

23、控作用、了解先天性心臟病的發(fā)病機制和基因治療打下基礎(chǔ)?；痦椖?國家攀登計劃基金資助劉蘭英（中山醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510089）楊琨（中山醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510089）朱振宇（中山醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510089）劉玉川（中山醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510089）余細勇（廣東省人民醫(yī)院心血管研究所， 廣東 廣州 510080）銀?。ㄖ猩结t(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510089）湯建（北京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)心血管研究所，北京 100089）馬澗泉（中山醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510089）顧軍

24、（中山醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心， 廣東 廣州 510089）參考文獻1Doetschman TC, Eistetter H, Kemler R, et al. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium J. J Embryol Exp Morph, 1985,87:2745.2Robbins J, Doetschman T, Jones WK, et al. Embry

25、onic stem cell as a model for cardiogenesisJ. Trends Cardiovasc Med, 1992,2:4450.3Moreadith RW, Radford NB. Gene targeting in embryonic stem cells: the new physiology and metabolism J. J Mol Med, 1997,75(3):208217.4Metzger JM, Lin WI, Johnston RA, et al. Myosin heavy chain expression in contracting myocytes isolated during embryonic stem cell cardiogenesis J. Circ Res, 1995,76(5):710719.5胡新立，尚克剛.6個小鼠ES細胞系的建立和鑒定J. 北京大