中藥合劑對(duì)缺氧性腦損害的抗氧化保護(hù)作用

1、中藥合劑對(duì)缺氧性腦損害的抗氧化保護(hù)作用              作者：肖峰， 姜正林， 李霞， 陳建， 潘永進(jìn)， 顧永健， 石中瑗【關(guān)鍵詞】  缺氧；中藥合劑；抗氧化；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；過(guò)氧化氫酶摘要：目的觀察中藥合劑對(duì)缺氧大鼠腦組織的抗氧化保護(hù)作用。方法中藥合劑的主要成分為丹參、當(dāng)歸、黨參、黃芪，生藥含量0.4 g/ml。以低壓艙減壓模擬缺氧，分別觀察低氧、常氧條件下中藥合劑對(duì)SD大鼠腦組織谷胱甘肽含量（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSHPX）和過(guò)氧化氫酶（

2、CAT）活性的影響，并檢測(cè)不同濃度中藥合劑在體外的抗羥自由基效力。結(jié)果低氧暴露動(dòng)物腦組織GSH含量下降，GSHPX和CAT活性降低（P0.01）。使用中藥合劑后，GSH與GSHPX顯著提高。常氧狀態(tài)下，中藥合劑就可提高GSH含量與GSHPX活性。體外實(shí)驗(yàn)顯示中藥合劑能直接清除H2O2/Co2+體系中產(chǎn)生的羥自由基。結(jié)論 在該實(shí)驗(yàn)條件下，中藥合劑對(duì)大鼠缺氧腦組織有一定的抗氧化神經(jīng)保護(hù)作用。藥物的這種作用與其提高機(jī)體自身的抗氧化能力以及其直接的清除自由基作用有關(guān)。關(guān)鍵詞：缺氧；  中藥合劑；  抗氧化；  谷胱甘肽過(guò)氧化物酶；  過(guò)氧化氫酶Anti-oxid

3、ative Protective Effect of Chinese Herbal Mixture on Hypoxic Rat BrainAbstract：ObjectiveTo observe the effect of Chinese herbal mixture against hypoxic brain in rats. MethodsHypoxic state was established in hypobaric chamber. We investigated the effects of Chinese herbal mixture on content of GSH, a

4、ctivities of GSH-PX and CAT of rat brain in both hypoxic and normoxic states. In another experiment, the hydroxyl radical scavenging activity of above mixture was measured in vitro using alizarin violet spectrophotometry.ResultsContent of GSH and activities of GSHPX and CAT all decreased significant

5、ly in hypoxic group, but GSH and GSHPX decreased less with pretreatment of Chinese herbal mixture. In normoxic state, GSH and GSH-PX were elevated with Chinese herbal mixture. In addition, Chinese herbal mixture scavenged hydroxyl radical in in vitro H2O2/Co2+ experimental system in a dosedependent

6、manner. ConclusionThe results suggest the mechanisms are related to the Chinese herbal mixture of this study plays an antioxidative neuroprotective role on rat brain exposed to hypoxia, and that elevation of the activity of anti-oxidative enzyme GSHPX and the content of GSH, and a direct free radica

7、l-scavenging effect.Key wordsHypoxia;  Chinese herbal mixture;  Anti-oxidation;  GSH-PX;  Catalaze   近年的實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為實(shí)施神經(jīng)保護(hù)是預(yù)防和治療缺氧腦損傷的有效措施，尤其是抗氧化藥物的研制和應(yīng)用已成為神經(jīng)元損傷防治研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外研制的許多西藥神經(jīng)保護(hù)劑由于具有一定的毒副作用，臨床應(yīng)用受到局限1。我國(guó)傳統(tǒng)中藥抗缺氧作用的研究表明，中藥具有作用溫和、保護(hù)作用和神經(jīng)細(xì)胞損傷的多樣性相一致的特點(diǎn)，但目前研究限于單味藥的較多，對(duì)復(fù)方制劑抗

8、氧化、清除自由基能力的報(bào)道不多。對(duì)丹參、當(dāng)歸、黨參、黃芪等中藥的研究表明，它們均具有提高機(jī)體對(duì)缺氧的耐受性，清除氧自由基，降低血黏度，改善微循環(huán)等多種功能2,3。我們運(yùn)用建立的低壓低氧模型，觀察預(yù)先給予上述藥物制成的合劑對(duì)缺氧腦損害的抗氧化保護(hù)作用及在體內(nèi)、體外的抗自由基的能力，并分析其可能的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料和方法1.1   材料 SD大鼠40只，其中用于缺氧研究的24只，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重(240±20) g，分為常氧組（雄性5只，雌性4只）、低氧組（8只，雌雄各半）、中藥合劑組（雄性4只，雌性3只）；用于常氧

9、狀態(tài)研究16只，購(gòu)于上海復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，體重(230±20) g，分成對(duì)照組和中藥合劑組，每組8只，均雌雄各半。中藥合劑由上海交通大學(xué)海洋水下工程科學(xué)研究院提供，主要成分為丹參、當(dāng)歸、黨參、黃芪，生藥含量0.4 g/ml。GSH，GSHPX，CAT試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。茜素紫（C20H12O7）Chroma公司生產(chǎn)，上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠分裝，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。1.2   方法  1.2.1  給藥方法中藥合劑組均于實(shí)驗(yàn)（缺氧）前48，24，1 h腹腔內(nèi)注射（i.p.）給藥，用量：1 ml/200 gwt。其余兩組注射等

10、量的生理鹽水。1.2.2  低氧暴露將中藥合劑組和低氧組動(dòng)物放入低壓艙內(nèi)（艙容積為0.01 m3），關(guān)閉艙門，調(diào)整艙內(nèi)壓力，在1 h內(nèi)分3階段將壓力減至相當(dāng)于海拔8 040 m高度的空氣壓力（03 1306 0808 040 m）；在中間兩階段分別停留10及15 min，保持8 040 m高度的壓力5 h后加壓出艙，加壓時(shí)間10 min。常氧組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照在艙邊常壓環(huán)境下停留6 h。1.2.3  樣本制備中藥合劑組和低氧組出艙后與常氧組動(dòng)物一起迅速斷頭，取左側(cè)腦組織，在04的冰冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重（約100130 mg），加9倍量的04生理鹽水，在冰水

11、浴中用玻璃勻漿器制成10腦勻漿，用離心機(jī)3 000 r/min，離心15 min，吸取上清液備測(cè)。常氧實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組和中藥合劑組動(dòng)物腦勻漿的制備于最后一次給藥后1 h進(jìn)行。1.3   檢測(cè)指標(biāo)   GSH，GSHPX，CAT 3種指標(biāo)的測(cè)定均依試劑盒說(shuō)明書按步操作。Folin酚法測(cè)定腦勻漿的蛋白含量。利用改良茜素紫光度法檢測(cè)H2O2/Co2+體系產(chǎn)生的羥自由基，測(cè)定中藥合劑對(duì)羥自由基的清除率4。測(cè)定時(shí)按文獻(xiàn)5每個(gè)藥物濃度作3個(gè)平行樣，計(jì)算其平均值。1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理腦勻漿的GSH，GSHPX，CAT測(cè)定結(jié)果用(±s)表示，用Stata

12、6.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析，兩兩比較用Scheffe法。羥自由基清除率的數(shù)據(jù)采用非線性回歸的Four parameter logistic standard curve模擬，按下式計(jì)算EC50：y = min + (max - min) / (1 + (x / EC50)Hillslope)。2  結(jié)果2.1  中藥合劑對(duì)缺氧處理后腦勻漿GSH，GSH-PX，CAT的影響結(jié)果見表1。表1  中藥合劑對(duì)大鼠缺氧處理后腦組織GSH，GSH-PX，CAT的影響（略）與常氧組比較，P0.01；與低氧組比較，*P0.05；#P0.01 

13、        表1顯示，大鼠經(jīng)低氧暴露后，腦組織GSH含量,GSH-PX和CAT活力3項(xiàng)指標(biāo)均明顯降低（P0.01）。預(yù)先使用中藥合劑后，再經(jīng)低氧暴露，此時(shí)三項(xiàng)指標(biāo)均有所回升，與低氧組比較GSH與GSH-PX的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或P0.01），但與常氧組比較降低仍很明顯（P0.01）。結(jié)果表明中藥合劑有一定的抗氧化神經(jīng)保護(hù)作用。2.2  中藥合劑對(duì)常氧狀態(tài)下腦勻漿GSH，GSH-PX，CAT的影響結(jié)果見表2。表2   中藥合劑對(duì)常氧狀態(tài)下腦組織GSH，GSH-PX，CAT的影響（略）

14、與生理鹽水組比較，*P0.05,*P0.01;n=8表2顯示，與生理鹽水組比較，中藥合劑組GSH，GSH-PX，CAT都有所升高，僅GSH，GSH-PX的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或P0.01）。表明常氧狀態(tài)下，中藥合劑能提高腦組織的GSH水平和GSH-PX活力，增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力。2.3  中藥合劑在體外抗羥自由基的作用結(jié)果見圖1。如圖1所示，中藥合劑在體外對(duì)羥自由基的清除率和藥物濃度有明顯的量-效關(guān)系，即濃度越大，清除效果越佳，但達(dá)到一定的濃度后即趨向飽和。根據(jù)計(jì)算，清除反應(yīng)體系中50%的羥自由基，中藥合劑的濃度(EC50)為：0.07 ml/10 ml，折合生藥濃度為2.

15、8 mg/ml。圖1  羥自由基的清除率與藥物濃度量-效關(guān)系（略）1  Chauhan N, Zhao ZH, Barber PA, et al. Lessons in experimental ischemia for clinical stroke medicineJ. Curr Opin Neurol, 2003, 16(1): 65.2  聞紅斌，章軍建.中藥對(duì)缺氧性腦損傷保護(hù)作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展J.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，12(10)：1114.3  張潤(rùn)峰，李  霞.丹參與缺血再灌注損傷研究進(jìn)展J.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003

16、，17(5):182.4  肖  峰，潘永進(jìn)，姜正林.對(duì)茜素紫光度法檢測(cè)H2O2/Co2+產(chǎn)生的羥自由基一文中自由基清除率計(jì)算公式的芻議J.化學(xué)試劑，2005, 27(5):301,304.5  熊輝巖，張曉峰，譚大風(fēng)，等.大黃屬三種植物不同部分提取物清除羥自由基的體外實(shí)驗(yàn)研究J.食品科學(xué),2003,24(1):128.6  Rauca C, Zerbe R, Jantze H, et al. The importance of free hydroxyl radicals to hypoxia preconditioningJ. Brain Res, 2000, 868(1): 14.7  蔡愛玲，康愛華.谷胱甘肽血紅蛋白與氧化應(yīng)激狀態(tài)J.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2002，23(3)：147.8  Crack PJ, Taylor JM, de Haan JB, et al. glutathione peroxidase-1 contributes to the neuroprotection seen in the superoxide dismutase-1 transgenic mouse in response to ischemia/reperfusi