鹽酸常山堿不同脂質(zhì)體及聚乙二醇結(jié)合物的構(gòu)建及評價

1、鹽酸常山堿不同脂質(zhì)體及聚乙二醇結(jié)合物的構(gòu)建及評價瘧疾是目前世界上發(fā)病率最高的熱帶病, 在導(dǎo)致死亡的主要傳染病中排名第四位。但 2018 年 WHO的世界瘧疾報告 顯示 , 近幾年全球瘧疾防治沒有取得任何重大進(jìn)展。尤其是青蒿素、氯喹等顯現(xiàn)出耐藥性, 使得瘧疾的防治工作面臨越來越大的挑戰(zhàn)。因此新型抗瘧藥的研發(fā), 對世界范圍內(nèi)瘧疾的消除起著重要作用。常山堿是從中藥常山中提取的一種喹唑酮型生物堿, 具有很強(qiáng)的抗瘧活性。但由于其嚴(yán)重的嘔吐、胃腸道損傷、肝損傷等毒副作用, 以及藥物化學(xué)性質(zhì)的不穩(wěn)定性 , 限制了其臨床應(yīng)用。作者團(tuán)隊前期的研究中將其制備成常山堿鹽酸鹽(Dichroa alkali salt)

2、,解決了常山堿穩(wěn)定性差的問題。并在研究中發(fā)現(xiàn), 靜脈注射給藥能顯著降低DAS的毒副作用 , 但同時抗瘧藥效明顯降低。本課題選擇研究了脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)和聚乙二醇化這兩種具有較好臨床轉(zhuǎn)化前景的方式 , 構(gòu)建了 DAS 普通脂質(zhì)體、具有緩釋作用的聚乙二醇化脂質(zhì)體、DAS-姜黃素復(fù)合脂質(zhì)體和具有瘧原蟲感染紅細(xì)胞靶向作用的靶向脂質(zhì)體, 以及三種不同分子量的PEG化常山堿 , 并對其體內(nèi)外的藥效和毒性進(jìn)行評價。旨在利用這幾種劑型各自不同的特點, 通過多方面的探索和比較, 尋找一種有效的方法 , 提高 DAS靜脈注射的抗瘧藥效 , 并進(jìn)一步降低 DAS引起的毒副作用 , 將 DAS開發(fā)為一種低毒高效的靜脈

3、注射制劑 , 作為無法口服藥物的瘧疾重癥患者的治療用藥。主要研究內(nèi)容如下 : 建立了 DAS含量測定的 HPLC分析方法 , 并進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果顯示 , 該方法在檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 , 重現(xiàn)性 , 精密度 , 方法回收率等均符合含量測定要求。對 DAS理化性質(zhì)進(jìn)行考察 , 結(jié)果顯示 ,DAS油水分配系數(shù)具有明顯的 pH依賴性 , 在正辛醇一水相中的親水親油平衡值 (1gP) 值隨水相 pH 值增大而增大。對比DAS在 120高壓蒸汽滅菌15min 后的回收率。結(jié)果表明 ,DAS回收率在 37.16-57.91% 之間 , 在 pH4-9 范圍內(nèi) ,DAS在高溫高壓環(huán)境下化學(xué)性質(zhì)并不十分

4、穩(wěn)定。對DAS脂質(zhì)體包封率測定方法進(jìn)行篩選, 考察葡聚糖凝膠微柱離心法和陽離子交換樹脂微柱離心法。結(jié)果表明 , 兩種方法均重現(xiàn)性良好 , 且操作簡便 , 快捷。綜合考慮 , 選擇成本更低的陽離子交換樹脂微柱離心法測定脂質(zhì)體包封率。對 DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體處方工藝進(jìn)行篩選 , 考察了磷脂種類、膽固醇用量、磷脂濃度、水化液濃度、藥脂比、載藥溫度、載藥時間等因素對DAS普通脂質(zhì)體包封率的影響; 載藥方法、磷脂種類、內(nèi)水相pH、內(nèi)水相緩沖液濃度、 DSPE-PEG2000用量、透析液種類、藥脂比等因素對聚乙二醇化脂質(zhì)體包封率的影響 , 分別確定了兩種脂質(zhì)體的最佳制備工藝。對DAS普通脂質(zhì)

5、體和聚乙二醇化脂質(zhì)體的表征進(jìn)行評價, 冷凍透射電鏡 (Cryo-TEM) 顯示 , 兩種脂質(zhì)體均為球形的單室脂質(zhì)體 , 平均粒徑分別為126.23 和 114.93 nm, 且都具有較好的粒度分布。DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體均表面帶負(fù)電,zeta電位分別為 -6.25和 -26.33 mV, 包封率分別為 89.43 和 96.42%。用透析袋法對兩種脂質(zhì)體的體外釋放行為進(jìn)行考察 ,DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體在體外均有明顯的緩釋作用 , 且聚乙二醇化脂質(zhì)體的緩釋作用更顯著。考察了兩種脂質(zhì)體的儲存穩(wěn)定性 , 兩種脂質(zhì)體在 4條件下 , 粒徑 , 粒度分布 ,Zeta 電位在 60

6、 天的考察時間內(nèi)都沒有明顯變化, 儲存穩(wěn)定性較好。 對 DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體進(jìn)行體內(nèi)外藥理學(xué)評價, 用 MSF法考察了 DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體對惡性瘧原蟲3D7 菌株的體外抗瘧活性 , 兩種脂質(zhì)體都顯著增強(qiáng)了體外抗瘧活性(P<0.01),其中聚乙二醇化脂質(zhì)體的抗瘧活性更好。用 MTS法測定 DAS藥物溶液、 DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體對HUVEC的細(xì)胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) , 聚乙二醇化脂質(zhì)體細(xì)胞毒性明顯低于DAS藥物溶液和普通脂質(zhì)體 (P<0.05),DAS藥物溶液和普通脂質(zhì)體細(xì)胞毒性無顯著性差異。DAS藥物溶液、 DAS普通脂質(zhì)體和聚

7、乙二醇化脂質(zhì)體溶血實驗表明, 在 37下孵育 1,3,6h 后, 除 DAS普通脂質(zhì) 50g·mL-組外 , 其他各組樣品的溶血率均小于 5%,說明 DAS,DAS普通脂質(zhì)體及聚乙二醇化脂質(zhì)體的血液相容性較好 , 可用于靜脈注射給藥。采用 Peter s 四天抑制實驗法對 DAS藥物溶液、普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體的體內(nèi)抗瘧活性進(jìn)行研究。DAS、普通脂質(zhì)體與聚乙二醇化脂質(zhì)體的ED50分別為 10.8 、5.48 和 1.9mg·kg-1 。DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體的體內(nèi)抗瘧藥效分別是原料藥的2 倍和 5 倍 , 藥效顯著提高。DAS、DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化

8、脂質(zhì)體靜脈注射給藥的急性毒性實驗中 ,DAS、普通脂質(zhì)體與聚乙二醇化脂質(zhì)體的 LD50值為 18.95 、19.14 、5.52 mgkg-1。對死亡小鼠進(jìn)行解剖 , 各組死亡小鼠都有明顯的胃腸道損傷。說明 DAS和 DAS普通脂質(zhì)體急性毒性相近 , 而聚乙二醇化脂質(zhì)體毒性明顯高于前兩者。根據(jù)體內(nèi)藥效學(xué)實驗和急性毒性實驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行治療指數(shù)(TI) 分析 ,DAS、普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體的治療指數(shù)分別為1.75 、3.49 、2.77 。雖然聚乙二醇化脂質(zhì)體抗瘧活性最好, 但由于急性毒性過大 , 其安全性低于DAS普通脂質(zhì)體。但與DAS相比 , 兩種制劑的安全性都明顯提高。由于與 DAS和

9、聚乙二醇化脂質(zhì)體相比,DAS普通脂質(zhì)體具有更好的安全性。故在普通脂質(zhì)體處方的基礎(chǔ)上, 與姜黃素聯(lián)用 , 制備了 DAS-姜黃素復(fù)合脂質(zhì)體。旨在利用姜黃素的抗瘧 , 保肝 , 胃腸道保護(hù)等特點 , 制備一種藥效更高 , 毒性更低的脂質(zhì)體制劑。復(fù)合脂質(zhì)體用分步載藥的方法進(jìn)行制備, 并對脂質(zhì)體的表征及體內(nèi)外藥理學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評價。脂質(zhì)體中姜黃素和DAS包封率均大于 80%。脂質(zhì)體多為表面光滑圓整的單室脂質(zhì)體 , 少數(shù)為雙層的多室脂質(zhì)體。粒徑在 10 nm左右 , 粒度分布小于 0.3, 脂質(zhì)體表面帶負(fù)電荷。用MSF法考察了復(fù)合脂質(zhì)體對惡性瘧原蟲3D7 菌株的體外抗瘧活性 , 其體外抗瘧活性顯著高于DAS

10、原料藥 (P<0.01)。對 HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果顯示, 其細(xì)胞毒性明顯低于DAS原料藥(P<0.01)。采用 Peter s 四天抑制實驗法考察其體內(nèi)抗瘧活性, 其體內(nèi)抗瘧活性的 EDs0為 5.64 mg·kg-1, 其抗瘧藥效高于 DAS原料藥 (ED50為 10.8 mg·kg-1),與 DAS普通脂質(zhì)體 (ED50為 5.48mg · kg-1) 接近。對復(fù)合脂質(zhì)體急性毒性進(jìn)行研究 , 其 LD50為 30.25 mg· kg-1, 約為 DAS普通脂質(zhì)體 (LD50 為 19.14mg·kg-

11、1) 及 DAS原料藥 (LD50 為 18.95mg· kg-1) 的 1.5倍。說明復(fù)合脂質(zhì)體在不影響DAS藥效的前提下 , 明顯降低了靜脈注射給藥的毒性。復(fù)合脂質(zhì)體的治療指數(shù)TI 為 5.36, 不但高于 DAS原料藥 , 還明顯高于 DAS普通脂質(zhì)體和聚乙二醇化脂質(zhì)體。 靶向脂質(zhì)體可以將藥物定向的運送到靶器官或靶組織 , 在局部給予足夠劑量的同時, 降低了藥物對其他組織和器官的毒性。因此我們對靶向于瘧原蟲感染紅細(xì)胞的DASpRBCs靶向脂質(zhì)體進(jìn)行初步研究。首先進(jìn)行處方工藝篩選 , 考察了水化液種類 , 磷脂濃度 , 膽固醇用量 , 藥脂比等因素對脂質(zhì)體包封率的影響, 構(gòu)建了以

12、膽固醇和陽離子磷脂DOPC、 DOTAP為膜材的陽離子脂質(zhì)體。分別將帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸和肝素鈉與陽離子脂質(zhì)體在一定條件下孵育, 使其靜電結(jié)合于陽離子脂質(zhì)體表面。構(gòu)建透明質(zhì)酸介導(dǎo)的pRBCs 靶向脂質(zhì)體(DAS-HA-Lip) 與肝素鈉介導(dǎo)的pRBCs靶向脂質(zhì)體 (DAS-DAS-Hep-Lip) 。Cryo-TEM顯示 , 兩種脂質(zhì)體皆為球形或類球形的單室脂質(zhì)體。粒徑在 150 nm左右 , 粒度分布均小于 0.3, 表面帶正電荷。采用 Peter s 四天抑制實驗法進(jìn)行小鼠體內(nèi)抗瘧活性研究, 在 1.5 mg·kg-1的劑量時 ,DAS-DAS-Hep-Lip 組小鼠轉(zhuǎn)陰率為30%

13、,DAS-HA-Lip組小鼠轉(zhuǎn)陰率為40%。在 3 mg·kg-1 的劑量時 ,DAS-DAS-Hep-Lip 組小鼠轉(zhuǎn)陰率為40%,DAS-HA-Lip組小鼠轉(zhuǎn)陰率為80%。在兩種劑量下 , 原料藥組小鼠轉(zhuǎn)陰率均為0%。說明兩種脂質(zhì)體均可以明顯的增強(qiáng)體內(nèi)抗瘧效果 , 而 DAS-HA-Lip 抗瘧效果更強(qiáng)。大量研究表明 , 藥物經(jīng)過 PEG修飾后 , 可以改變其在體內(nèi)的分布和代謝特征,增加藥物藥效 , 降低其毒副作用。 而且相較于脂質(zhì)體 , 與藥物以共價鍵結(jié)合的PEG化制劑化學(xué)性質(zhì)更為穩(wěn)定, 成藥性更強(qiáng)。因此 , 我們將 DAS分別與分子量為 1000,5000,20000 的聚乙

14、二醇 (PEG)共價結(jié)合 , 合成了 PEG-1K-DAS、 PEG-5K-DAS、 PEG-2W-DAS三種不同分子量的 PEG化常山堿制劑 , 并對三種制劑進(jìn)行體內(nèi)外藥效與毒理學(xué)評價。 PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS對惡性瘧原蟲 3D7菌株的體外抗瘧活性實驗結(jié)果顯示,PEG-1K-DAS無明顯的抗瘧活性 ,PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS體外抗瘧 IC50 分別為 19.88 ±1.08,11.42 ±0.980nM, 體外抗瘧活性明顯低于DAS原料藥 (P<0.01)。通過對 HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn),

15、PEG-1K-DAS、 PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS的細(xì)胞毒性均明顯低于DAS原料藥 (P<0.01),并且三種 PEG化常山堿的細(xì)胞毒性PEG-2W-DAS>PEG-5K-DAS>PEG-1K-DAS。對 PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS、PEG-2W-DAS的溶血性進(jìn)行評價 , 在 37 下孵育 1,3,6 h后, 三種樣品的溶血率均小于5%,說明三種 PEG化常山堿的血液相容性較好, 可用于靜脈注射給藥。采用 Peter s 四天抑制實驗法 , 對三種 PEG化常山堿的體內(nèi)抗瘧活性進(jìn)行研究 ,PEG-1K-DAS、PEG-5K-DAS有一定抗瘧效果 ,PEG-1K-DAS雖然可以明顯降低染蟲率 , 但是在實驗劑量內(nèi) , 轉(zhuǎn)陰率為 0%,PEG-5K-DAS在 6 mg·kg-1 的轉(zhuǎn)陰率為 20%?？汞懶Ч詈玫氖?PEG-2W-DAS,其抗