南方醫(yī)科大學微生物試驗報告

1、2016年南方醫(yī)科大學醫(yī)學微生物學實驗報告 日期2016年5月22號 題目 膿汁和典便標本中病原菌的檢測 成績 實驗者 作者：馬浩楠 3140020007 參與者名字： 馬浩楠丁超王堯鑫桂義茁 年級專業(yè) 2014級醫(yī)學影像專業(yè) 指導老師 羅軍 一、實驗目的 1 1、掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。 2 2、掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。 3 3、掌握油鏡的正確使用、細菌涂片標本的制備、革蘭氏染色法，熟悉細菌基本形態(tài)。 4 4、熟悉幾種常用的細菌生化反應的名稱、原理、方法、結(jié)果分析及用途。 5 5、掌握血漿凝固酶試驗的原理、方法及用途。 6 6、熟悉藥物敏感性試驗方法的種類、原理及應用，掌握紙片擴

2、散法。 7 7、掌握玻片凝集試驗的原理、方法、結(jié)果觀察與判斷。 二、實驗器材 1 1、天平、稱量紙、干粉培養(yǎng)基、錐形瓶、量筒、1515 支試管、試管架、試管筐、 5ml5ml 刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精燈 2 2、膿汁標本 1 1 支，糞便標本 1 1 支；伊紅美蘭平板 2 2 個，營養(yǎng)瓊脂平板 2 2 個，伊紅美藍平板 2 2 個，接種環(huán)，酒精燈 3 3、斜面 4 4 支、細菌分離培養(yǎng)物（上次實驗平板） 4 4、斜面培養(yǎng)物 4 4 支，營養(yǎng)肉湯 4 4 支，生理鹽水 2 2 支，鏡油瓶、拭鏡紙 1 1 套，吸水紙 1 1 本，載玻片 4 4 張，染色瓶，染色架 5 5、斜面培養(yǎng)物 4 4

3、支，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(菌液)4 4 支，半固體瓊脂 4 4 支，營養(yǎng)瓊脂平板 4 4 個，糖發(fā)酵管 1 1 套，抗菌素紙片 1 1 套，眼科銀子 2 2 把 6 6、半固體培養(yǎng)物 4 4 支，藥敏試驗培養(yǎng)物 4 4 個，微量發(fā)酵管培養(yǎng)物 1 1 套。 三、方法與步驟 1 1、培養(yǎng)基的制備: 稱量干粉培 養(yǎng)基(g)(g) 水量(ml)(ml) 煮沸(次) 分裝(ml)(ml) 備注 營養(yǎng)瓊脂 11.411.4 300300 3 3 瓶,500ml500ml 瓶，平板 營養(yǎng)瓊脂 2.72.7 7070 3 3 5 5 1414 支 X3,X3,中試管，斜面 營養(yǎng)肉湯 1.31.3 6060 1 1

4、3 3 2020 支 X2,X2,小試管，肉湯 半固體瓊脂 1.71.7 6060 3 3 4 4 1414 支 X3,X3,小 試管，高層 (1)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備：稱量11.4g瓊脂，置于三角燒瓶中，加入300ml蒸儲水，分2瓶裝，用于倒平板。 (2)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的制備(用于制作斜面)：稱量2.9g瓊脂，置于三角燒瓶中，加入 75ml蒸儲水，放在電爐上，先后煮沸3次，分15支中試管裝，每支試管5ml。 (3)肉湯培養(yǎng)基的制備(用于制作液體培養(yǎng)基)：稱量1.1g瓊脂，置于三角燒瓶中，加 入50ml蒸儲水，放在電爐上，煮沸1次，分15支小試管裝，每支試管5ml。 (4)半固體瓊脂培養(yǎng)基的制

5、備：稱量1.7g瓊脂，置于三角燒瓶中，加入60ml蒸儲水，放 在電爐上，先后煮沸3次，分15支中試管裝，每支試管4ml。 2 2、細菌的分離培養(yǎng) 平板劃線分離法 甲 f f 膿汁標本-營養(yǎng)瓊脂平板（黃色）乙-膿汁標本-營養(yǎng)瓊脂平板（黃色）內(nèi)一糞便標本一伊紅美藍平板（紫色）丁一糞便標本一伊紅美藍平板（紫色）步驟：接種環(huán)燒灼滅菌。取標本 3 36ul6ul。平板采光，當看到平板表面象鏡面有反光的時候，保持這個角度，劃線時就能看清劃線痕跡，以便控制劃線。 接種環(huán)與平板呈 30304040 度角，在平板表面上方，以曲線的形式，作大幅度來回連續(xù)劃線，邊劃邊退，線段要劃得長而密集，每區(qū)劃線不少于 3030

6、 條。燒掉 接種環(huán)上多余的標本。轉(zhuǎn)動平板，通過第一區(qū) 5 57 7 次，使接種環(huán)重新沾上少 量細菌，同樣的方法劃第二區(qū)。轉(zhuǎn)動平板，接種環(huán)通過第二區(qū) 1 1 次，劃第三區(qū)。轉(zhuǎn)動平板，接種環(huán)通過第三區(qū) 1 1 次，劃第四區(qū)。劃第五區(qū)。 3 3、細菌的純培養(yǎng) 斜面接種分工 甲 f f 普通平板黃色菌落-1 1 支斜面乙普通平板白色菌落1 1 支斜面 內(nèi)-EMWEMW 板-紫黑菌落-1 1 支斜面丁-EMBEMB 平板-粉紅菌落-1 1 支斜面 方法：接種環(huán)套住菌落輕刮取菌-接種環(huán)取菌后，伸入斜面底部，自下向上 先拉條細菌接種線-再伸入底部，自下向上，作蜿蜒劃線-細菌涂布接種在斜面培養(yǎng)基的表面斜面正面

7、上 2/32/3 作標記：組號、顏色收集平板-滅菌桶內(nèi) （平板底部朝下，蓋朝上放置）速送滅菌室-高壓蒸汽滅菌-洗刷。 4 4、細菌的形態(tài)學檢查 涂片干燥固定染色 （1 1）涂片-干燥-固定 甲 f f 黃色，紫黑。乙-白色，粉紅。 丙-黃色，紫黑。丁-白色，粉紅。 方法：涂片：接種環(huán)取鹽水 3ulX23ulX2 滴，水滴間距小于 2cm;2cm;取菌苔少許（1mm1mm 小菌落半個）與鹽水混勻，涂成大于 lcm2;lcm2;涂畢環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。-干燥固定：手持載玻片-端，涂膜朝上，兩個涂膜快速通過火焰外層 3 3 次，時間 2?32?3 秒鐘。 革蘭染色 涂

8、片-干燥-固定-結(jié)晶紫-初染 1 1 分鐘-水洗-盧戈碘液-媒染 1 1 分鐘-水洗95%95%乙醇月色約 2020秒鐘一 7 7 尺洗一稀釋品紅一復染 1 1 分鐘一水洗一吸干， 鏡檢。 油鏡使用方法： 10X10X 物鏡一看清標本一滴加香柏油一 100X100X 油鏡一浸泡油中模糊物象-細調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像-記錄結(jié)果-關(guān)閉電源-擦鏡紙拭去香柏油一 擦鏡紙沾少許乙醇和乙醴（7:37:3）混合液擦拭-擦鏡紙擦拭油鏡。 5 5、液體培養(yǎng)基接種（肉湯接種）甲 f f 金黃色，乙-白色，丙-紫黑，丁-粉紅。 方法：（1 1）接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接種；（2 2）在管壁上，將接種

9、環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌；（3 3）標記：組號，顏色 6 6、細菌的生化試驗等 （1 1）細菌的糖發(fā)酵實驗： 在紫黑色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有葡萄糖的發(fā)酵管中，并做好 標記 在紫黑色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有乳糖的發(fā)酵管中，并做好標 記 在粉紅色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有葡萄糖的發(fā)酵管中，并做好 標記 在粉紅色的斜面培養(yǎng)基取適量菌落接種在含有乳糖的發(fā)酵管中，并做好標 記 步驟：用砂輪在糖發(fā)酵管液面上方 2 23cm3cm 處，切割一道切痕。兩手握住發(fā)酵管將管子折斷。管口燒灼滅菌。接種針斜面取菌，伸入培養(yǎng)基內(nèi)，在管壁上，上下研磨接種。退出接種針，燒灼滅菌。管口朝向

10、相同，放置在平皿內(nèi)。 （2 2）抗菌素敏感性試驗 紙片擴散法 甲 f f 黃色菌液乙-白色菌液 丙-紫黑菌液丁-粉紅菌液 方法： 先取-環(huán)菌液； 沿平板直徑拉一條細菌接種線； 再取一環(huán)菌液； 旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角，拉另一條接種線， 使兩條細菌接種線呈“十字形”； 然后在平板上半部， 作連續(xù)來回密集劃線，每次劃二分之一平板；旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角， 二次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角， 三次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平板 9090 度角， 四次密集劃線；設(shè)三點，呈等邊三角距離；點距離平板邊緣約 15mm;15mm; ?作標記：青、先、慶；？銀子尖嘴朝下，夾取相應藥物紙片的邊緣，平貼在已設(shè)定的位置上

11、，輕輕按壓紙片。 (3)(3)血漿凝固酶試驗 步驟： 取二滴兔血漿置于潔凈的玻片上。 分別用接種環(huán)取白色和金黃色菌苔(約 2 23 3 個菌落的菌量)與血漿研磨混合成直徑 8 810mm10mm 勺一層薄菌膜。立即觀察結(jié)果。 (4)(4)半固體穿刺接種法 用接種針取紫黑色菌落垂直刺入半固體培養(yǎng)基，再按原路返回，并做好標記 用接種針取粉紅色菌落垂直刺入半固體培養(yǎng)基，再按原路返回，并做好標 記 步驟：接種針斜面取菌，從半固體中心，垂直刺入，到達培養(yǎng)基底部 5 5 分之 4 4 處，再循原來的路線，退出接種針。管口、接種針經(jīng)火焰燒灼滅菌37c37c 下培養(yǎng) 18241824 小時。 7 7、細菌的血

12、清學試驗、結(jié)果分析 玻片凝集試驗 取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對照區(qū)，滴加生理鹽水 15ul15ul。遠 端設(shè)為試驗區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清 15ul15ul, , 用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約 2 2 個小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻。 載玻片來回傾側(cè)，讓菌液充分混勻，凝集速度更快、結(jié)果更清楚。 觀察記錄結(jié)果：菌液凝集者記為陽性，菌液均勻混濁記為陰性。 四、結(jié)果與討論 (一)實驗結(jié)果 1 1 . .洗手前后對比 圖片分析：洗手圖不是很理想，上面同學的洗手后與消毒后與預期的不一致，可能是操作不當引起的。 2 2 . .細菌的分離培養(yǎng)結(jié)果： (1)(1)膿汁標本在普通平板上有

13、黃色、白色兩種菌落，菌落的色素是脂溶性的，是細菌本身的顏色。菌落直徑 2mn2mn右、圓形、隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、不透明。 (2(2)糞便標本在伊紅美藍平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落，菌落色素是水溶性的，不是細菌本身的顏色，紫黑色菌落具有金屬光澤、大而隆起、不透明的菌落，菌落直徑 2?2?3mm3mm 粉紅色菌落淡粉紅色，半透明，直徑 1?1?2mm.2mm. 圖片分析：由于同學都是第一次劃線，所以劃線都不是很好。 3 3 .細菌的純培養(yǎng)： 在斜面培養(yǎng)基上得到四種菌體的純培養(yǎng)標本，從普通平板上挑取的黃色或白色 菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，黃色或白色。 從伊紅美

14、藍平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌 落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤、光滑、前者不透明，后者透明 圖片分析：中間兩組效果不好，可能來自于采菌過少或者劃線操作不當 4,4,細菌的形態(tài)學檢查 膿汁標本（左邊為白色菌苔，右圖為金黃色菌苔） 糞便標本(左圖為粉紅菌苔，右圖為紫黑色菌苔) 鏡下觀察：用普通平板，從濃汁標本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細菌，顯微鏡油鏡下均為 G+G+求菌，排列不規(guī)則，呈葡萄用狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。 用伊紅美藍平板，從糞便標本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能

15、是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為 G G- -桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細菌。 6.6.細菌的生化試驗等： (1)(1)半固體穿刺接種法 圖片分析：實驗效果與預期一致，但是拍攝效果不是很好 四組的半固體培養(yǎng)接種的培養(yǎng)圖，由于拍攝效果不好，但是依然可以分辨生長的情況。 直線生長的表明無鞭毛。 細菌的糖發(fā)酵試驗 糖發(fā)酵實驗結(jié)果圖.從下至上分別為: (粉紅一乳糖粉紅一葡萄糖紫黑一乳糖紫黑一葡萄糖) 編號 菌苔 糖發(fā)酵管 反應現(xiàn)象 結(jié)果描述 符號 甲 紫黑 糖發(fā)酵管變 黃色有氣泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸又產(chǎn)氣 乙 紫黑 糖發(fā)酵管變 黃色有氣

16、泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸又產(chǎn)氣 丙 粉紅 糖發(fā)酵管變 黃色無氣泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸/、產(chǎn)氣 + + 丁 粉紅 糖發(fā)酵管變 紫色無氣泡 分解 X X 糖產(chǎn) 酸/、產(chǎn)氣 - - +:產(chǎn)酸或陽性：產(chǎn)酸產(chǎn)氣- -:陰性 紫黑細菌微型發(fā)酵關(guān)內(nèi)液體變黃，產(chǎn)生氣泡，氣泡的高度分別為 10mnf10mnf 口 17mm17mm 說明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅細菌只分解葡萄糖，不產(chǎn)氣，不分解乳糖。 (3)(3)抗菌素敏感試驗結(jié)果 圖片分析：.3.3 號同學劃線最好，本人 4 4 號劃線不好，還是沒有劃好。2 2 號同學效 果不好，可能取菌過少。 4:濃汁標本中白色菌落3:濃汁標本中

17、金黃色菌落 2:糞便標本中粉色菌落1:糞便標本中紫黑色菌落 藥敏試驗結(jié)果分析 青霉素 頭抱曲松 慶大毒素 金黃色 + + + 白色 + + 紫黑 - + + 粉紅 - + + -:耐藥 士：中度敏感 十:敏感 白色細菌對對青霉素敏感，對頭抱曲松中度敏感，對慶大毒素敏感 金黃細菌對青霉素敏感，對頭抱曲松敏感，對慶大毒素敏感紫黑細菌對青霉素耐藥，對頭抱曲松敏感，對慶大毒素敏感粉紅細菌對青霉素耐藥，對頭抱曲松敏感，對慶大毒素敏感（4 4）血漿凝固酶實驗結(jié)果： 金黃色（左）與白色（右）菌苔 1 1、白色菌苔不發(fā)生凝塊，容易涂抹。呈均勻乳白狀態(tài)。 2 2、黃色菌苔能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原

18、轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附著于菌體表面，形成凝塊，涂抹不開。說明黃色細菌為致病菌。 7 7.玻片凝集試驗: 由實驗結(jié)果圖可看到，生理鹽水一端（左）不出現(xiàn)凝集，福氏志賀菌診斷血清一端（右）菌液雖然不是很不明顯，但是可以看到任有少量絮狀沉淀，表明為陽性。說明粉紅菌為福氏志賀菌。 8.8.結(jié)論： 對照對照常見腸道感染細菌主要生化反應特征，血清學分析，說明黃色菌落是金黃色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大腸埃希菌；粉紅色菌落是福氏志賀菌。 （二）實驗討論 1 1 . .分析： 制備好培養(yǎng)基后，首先采用平板劃線分離法，從膿汁標本中分離出金黃色和白色兩種菌落。顯微鏡下，這兩株細菌均為 G+G+求菌，排列不規(guī)則，呈葡萄用狀，是典型的葡萄球菌；結(jié)合菌落或菌苔顏色，這兩株葡萄球菌分別是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通過血漿凝固酶試驗鑒別，金黃色葡萄球菌是致病菌。最后通過藥敏試驗，可見不同的抗生素所形成的抑菌圈不同，其中金黃色葡萄球菌對青霉素最敏感，而紫黑和粉紅細菌對青霉素