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1、內(nèi)內(nèi) 容容 ELISA的概念 酶聯(lián)免疫吸附試驗的反應(yīng)原理及操作中注意事項 常見問題原因分析及解決 結(jié)果的報告解釋第1頁/共48頁ELISA的概念的概念 ELISA屬于標記免疫學(xué)技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出，操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在免疫學(xué)檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。 ELISA是一種免疫測定（immunoassay，IA） 。基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。第2頁/共48頁抗原抗體反應(yīng) 可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其

2、反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb 抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=AgAbAgAb ,AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。第3頁/共48頁特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補關(guān)系，具有高度的特異性。 測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。第4頁/共48頁最適比例 第5頁/共48頁敏感性化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5-10g/ml免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)

3、法相仿標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。第6頁/共48頁常見問題常見問題ELISA技術(shù)掌握不好-較大的技術(shù)難題 白 板 花 板 灰 區(qū) 假 陰 性 假 陽 性第7頁/共48頁第8頁/共48頁白白 板板第9頁/共48頁花花 板板第10頁/共48頁均均 板板第11頁/共48頁灰灰 區(qū)區(qū)第12頁/共48頁競爭法競爭法第13頁/共48頁ELISAELISA檢驗方法相關(guān)項目檢驗方法相關(guān)項目 乙肝抗原、抗體 丙肝抗體 梅毒抗體 艾滋抗體-第14頁/共48頁ELISA ELISA 常見類型常見類型1.雙抗體夾心法（用于測抗原）HBsAg2.間接法（

4、用于測抗體） HBsAb3.競爭法（用于測小分子抗原/半抗原和抗體）HBeAb4.捕獲法（用于測血清中某抗體的亞型）特異IgG第15頁/共48頁第16頁/共48頁第17頁/共48頁 鉤狀效應(yīng) 強陽性-假陰性方法：稀釋后再測特點：不易發(fā)現(xiàn)避免：結(jié)果回顧、診斷提示、臨床溝通第18頁/共48頁第19頁/共48頁間接法的影響因素間接法的影響因素第20頁/共48頁正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體對間接法的影正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體對間接法的影響響 假陽性 鑒別 結(jié)果回顧、診斷提示、臨床溝通 復(fù)檢 必要時另一試劑盒復(fù)檢第21頁/共48頁小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點第22

5、頁/共48頁抗原的固相化既可以直接進行，亦可以通過相應(yīng)特異抗體而間接固相化第23頁/共48頁酶及底物酶及底物酶酶 底底 物物顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 測定波測定波長長 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 鄰苯二胺鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯胺四甲替聯(lián)苯胺氨基水楊酸氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺鄰聯(lián)苯甲胺2,2-2,2-連胺基連胺基-2(3-2(3-乙基乙基- -并并噻唑啉磺酸噻唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 橘紅色橘紅色黃色黃色棕色棕色蘭色蘭色藍綠色藍綠色492492450450449449425425642642堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸鹽硝基酚磷酸鹽(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸鹽

6、磷酸鹽+ +重氮鹽重氮鹽 黃色黃色紅色紅色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+ +甲硫酚嗪甲硫酚嗪+ +噻唑蘭噻唑蘭 黃色黃色深藍色深藍色 405405420 420 -半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基傘酮基半乳糖苷甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG) (ONPG) 熒光熒光黃色黃色 360,450360,450420420 第24頁/共48頁對照設(shè)定 u 陽性對照品 陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標本的組成相一致，多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì)。u 陰性對照品 陰性對照

7、品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。第25頁/共48頁ELISAELISA操作中的注意事項操作中的注意事項標本采集、保存試劑準備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷第26頁/共48頁 溶血標本及混有紅細胞的血清易產(chǎn)生假陽性,因溶血血清中含有過氧化酶,造成假陽性 受細菌污染因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶,造成假陽性 在冰箱中保存過久的標本，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底過深,造成假陽性 EDTA、酶抑制劑(如NaN3)可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性,造成假陰性 標本凝固不全,形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果 標本中有內(nèi)源性干擾物, 不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因

8、子、補體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其他物質(zhì)等標本采集、保存第27頁/共48頁試劑的準備試劑的準備 選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準確的關(guān)鍵 室溫平衡 所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量試劑準備第28頁/共48頁 加加 樣樣 應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部。每次加標本應(yīng)更換吸頭。震蕩充分混勻。從滴瓶中滴加試劑，要注意滴加角度和滴加速度。避免標本“交叉污染”問題。 加樣第29頁/共48頁 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）。 37是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 溫育時間足夠。 保溫的方式一般采用水浴或電熱塊。 溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。保 溫第30頁/共48

9、頁洗洗 板板分離游離的和結(jié)合的酶標記物洗板的方式：自動洗板儀；手工操作有浸泡式和流水沖洗式傾倒液體的方式 甩干孔內(nèi)液體：應(yīng)注意交叉污染和個人防護 吸干孔內(nèi)液體：吸干應(yīng)徹底，可用水泵或真空 泵抽吸（推薦） 如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。第31頁/共48頁顯色顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。OPD底物顯色一般在37反應(yīng)20-30分鐘。TMB約40分鐘顯色達頂峰。第32頁/共48頁 比比 色色 p 加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測定前應(yīng)振蕩混勻。p

10、正確選擇波長和參比波長。p 酶標儀使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。第33頁/共48頁結(jié)果判定定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的簡單回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。“陽性”表示該標本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)?！瓣幮浴眲t為無反應(yīng)。定性測定結(jié)果確定的依據(jù)在于陽性陰性判定值（Cut-off）的建立。在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。第34頁/共48頁 定量測定的結(jié)果判定是每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線，根據(jù)標本的吸光度值不同來

11、確定待測物的濃度。 在間接法和夾心法ELISA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。第35頁/共48頁灰區(qū)概念 把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區(qū)概念，即將CO值上下的一段區(qū)域定為陽性可疑，需重復(fù)實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區(qū)范圍內(nèi)則報告+（陽性）。第36頁/共48頁 酶標儀是垂直光路測定吸光度。垂直光的特點是樣本吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小，不足之處是易受被測樣本液面是否水平，酶標板透光性孔底是否平整等的影響較大。 酶標儀在用單波長測定吸光度時，受到測定干擾（樣本的濁度、干擾色等）、電路干擾（包括噪音、漂移、電壓等）和液體表面張力

12、的影響也很大。酶標儀單、雙波長檢測的比較酶標儀單、雙波長檢測的比較 第37頁/共48頁 雙波長的測定時采用兩個不同波長(測定波長450和參比波長630)同時測定一個樣品的吸光度，它們的差值是樣品相對準確的吸光度，這樣就會減少了測定干擾和電路干擾。 雙波長差吸光度法具有可以克服一些外界環(huán)境的影響共存組分吸收譜疊加的干擾，以及減少比色的光學(xué)不均一性等特點，吸光度在一定的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。 雙波長測定明顯比單波長更適合于生物活性測定實驗，其可以提高實驗結(jié)果分析的準確度，減少實驗誤差。第38頁/共48頁結(jié)果的解釋結(jié)果的解釋乙肝五項的結(jié)果解釋 1,3,5或1,3 大三陽 1,4,5或1,5 小三陽

13、 全陰或Sb陽性 除此之外一律復(fù)查第39頁/共48頁 丙肝抗體ELISA檢測試劑現(xiàn)已發(fā)展至第三代試劑，第三代試劑的靈敏度和特異性比前兩代試劑都高。第一代試劑利用來自HCV病毒基因組中的部分NS3和NS4區(qū)重組表達抗原（C100）作為固相包被進行檢測；第二代試劑利用來自HCV基因組NS3區(qū)的C33C和部分NS4區(qū)的融合表達抗原（C200）、再加上C區(qū)的核心抗原C22-3作為固相包被進行檢測；第三代試劑在第二代抗原的基礎(chǔ)上，又加入了來自NS5區(qū)的重組表達抗原，另外，部分公司的產(chǎn)品中又引進了合成肽抗原。第40頁/共48頁 初篩用的HIV ELISA試劑目前已經(jīng)發(fā)展到第四代檢測試劑。第一代試劑主要以病

14、毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應(yīng)板，以檢測血清中的抗體。由于包被的抗原不很純,假陽性率較高。第二代試劑使用基因工程方法得到的重組抗原和合成肽包被反應(yīng)板，由于純化抗原的使用，特異性有了很大提高。第三代試劑使用雙抗原夾心法檢測抗體，進一步提高了敏感性。第四代試劑則在第三代的基礎(chǔ)上進一步增加了P24抗原的檢測，把HIV抗原和抗P24的抗體同時包被反應(yīng)板，可同時檢測血清中的HIV抗體和P24抗原。第41頁/共48頁 梅毒螺旋體感染的免疫測定 非特異性實驗（類脂質(zhì)抗原血清學(xué)實驗） 梅毒螺旋體在破壞機體組織的過程中，體內(nèi)釋 放出一種心磷脂抗原，這種抗原可刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體即反應(yīng)素，其與牛心中提取的

15、心磷脂在體外可產(chǎn)生免疫結(jié)合反應(yīng)。此類試驗包括 VDRL ,USR(顯微鏡觀察) RPR,TRUST(肉眼觀察) RPR主要用于治療效果的監(jiān)測。 第42頁/共48頁 特異性試驗 梅毒螺旋體抗體檢測主要包括 熒光密螺旋體抗體吸收試驗FTA-ABS、 梅毒螺旋體血凝試驗TPHA、 梅毒螺旋體明膠凝集試驗TPPA和ELISA。 臨床中常用的有TPPA試驗和ELISA法。第43頁/共48頁 TPPA結(jié)果的判定方法 反應(yīng)圖像判定粒子成紐扣狀凝集，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且光滑的圓形（-） 粒子形成小環(huán)狀，呈現(xiàn)出外周邊緣均勻且平滑的圓形（） 粒子環(huán)明顯變大，其外周邊緣不均勻且雜亂地聚集在周圍（+） 產(chǎn)生均一的凝集，凝集粒子在底部整體上呈膜狀延展（+） 第44頁/共48頁HIV和和