上海交通大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)課件實(shí)驗(yàn)九動(dòng)物病毒培養(yǎng)

1、實(shí)驗(yàn)九實(shí)驗(yàn)九病毒的分離與培養(yǎng)病毒的分離與培養(yǎng)p101實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦斫獬Ｒ?guī)的病毒培養(yǎng)的基本方法理解常規(guī)的病毒培養(yǎng)的基本方法掌握利用雞胚培養(yǎng)病毒的原理掌握利用雞胚培養(yǎng)病毒的原理掌握雞胚接種的基本路徑掌握雞胚接種的基本路徑學(xué)會(huì)雞胚的鑒別學(xué)會(huì)雞胚的鑒別病毒的種類專性活細(xì)胞寄生專性活細(xì)胞寄生動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒l雞胚接種雞胚接種l細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)植物病毒植物病毒細(xì)菌病毒細(xì)菌病毒l噬菌體噬菌體從病料中分離病毒從病料中分離病毒一、樣本的采集與處理一、樣本的采集與處理1 1、一般原則：、一般原則： 合適的時(shí)間，合適的病變部位，合適合適的時(shí)間，合適的病變部位，合適的處理和保存方法的處理和保存方法 一般都要一般都要44保

2、存保存2 2、病料的種類、病料的種類動(dòng)物樣本：動(dòng)物樣本：（1 1）心、肝、肺、脾、腎臟和淋巴結(jié)等實(shí)質(zhì)性器官）心、肝、肺、脾、腎臟和淋巴結(jié)等實(shí)質(zhì)性器官（2 2）各種液體病料）各種液體病料 （3 3）腸內(nèi)容物和腸壁）腸內(nèi)容物和腸壁（4 4）皮膚病料）皮膚病料 （5 5）骨）骨 （6 6）腦、脊髓）腦、脊髓 植物樣本：植物樣本： 發(fā)病植株的根、莖、葉、花、果等發(fā)病植株的根、莖、葉、花、果等環(huán)境樣本環(huán)境樣本水樣、土壤、動(dòng)物糞便等水樣、土壤、動(dòng)物糞便等；采集病料應(yīng)具有針對(duì)性：在采集病料時(shí)應(yīng)有重點(diǎn)地采采集病料應(yīng)具有針對(duì)性：在采集病料時(shí)應(yīng)有重點(diǎn)地采集有關(guān)臟器、內(nèi)容物、分泌物、排泄物或其他材料。集有關(guān)臟器、內(nèi)

3、容物、分泌物、排泄物或其他材料。在無(wú)法估計(jì)病因時(shí)，可全面采集病料。進(jìn)行流行病學(xué)在無(wú)法估計(jì)病因時(shí)，可全面采集病料。進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查、抗體檢測(cè)、群體健康評(píng)估或環(huán)境衛(wèi)生檢測(cè)時(shí)，調(diào)查、抗體檢測(cè)、群體健康評(píng)估或環(huán)境衛(wèi)生檢測(cè)時(shí)，樣品的采集數(shù)量不能太少，應(yīng)具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣品的采集數(shù)量不能太少，應(yīng)具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B. B. 無(wú)菌采樣：采集所用的器械、樣品管等均應(yīng)消毒滅菌，無(wú)菌采樣：采集所用的器械、樣品管等均應(yīng)消毒滅菌，采集過程應(yīng)保持無(wú)菌操作，不同個(gè)體、不同組織樣品采集過程應(yīng)保持無(wú)菌操作，不同個(gè)體、不同組織樣品應(yīng)作好標(biāo)。應(yīng)作好標(biāo)。C. C. 采集新鮮病料：動(dòng)物發(fā)病后應(yīng)立即采集病料，否則，采集新鮮病料：動(dòng)物發(fā)病后應(yīng)

4、立即采集病料，否則，尸體腐敗會(huì)影響采樣和檢測(cè)效果，特別是用于病理學(xué)尸體腐敗會(huì)影響采樣和檢測(cè)效果，特別是用于病理學(xué)檢查的病料更應(yīng)及時(shí)采集。檢查的病料更應(yīng)及時(shí)采集。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)3、送檢病料樣本的標(biāo)記送檢病料樣本的標(biāo)記（1 1）送檢病料的物種、年齡、性別、發(fā)病日期、死）送檢病料的物種、年齡、性別、發(fā)病日期、死亡時(shí)間等。亡時(shí)間等。（2 2）流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、病理剖檢等初步診斷材）流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、病理剖檢等初步診斷材料。料。（3 3）免疫接種和用藥治療情況。）免疫接種和用藥治療情況。（4 4）病料中是否加有一些特殊的保護(hù)劑。）病料中是否加有一些特殊的保護(hù)劑。（5 5）送檢的目的和要求。）送檢的

5、目的和要求。（6 6）姓名和聯(lián)系方式。）姓名和聯(lián)系方式。4、待檢病毒材料的處理：、待檢病毒材料的處理：（1 1）組織材料需經(jīng)剪碎、研磨后，以漢克氏液作）組織材料需經(jīng)剪碎、研磨后，以漢克氏液作1 1：1010稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各1000IU1000IU，再反復(fù)凍融，再反復(fù)凍融3 3次，使病毒從細(xì)胞中釋放出來(lái)，次，使病毒從細(xì)胞中釋放出來(lái)，3000-40003000-4000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分鐘分鐘離心離心2020分鐘，取上清液微孔濾膜過濾后作為接種物。分鐘，取上清液微孔濾膜過濾后作為接種物。（2 2）分泌物、糞便等材料則可直接以漢克氏液作）分泌物、糞便等材料則可直接以

6、漢克氏液作1 1：1010稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各稀釋，每毫升加入青、鏈霉素各1000IU1000IU，44放置過放置過夜，夜，3000-40003000-4000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分鐘離心分鐘離心2020分鐘，取上清液作為接分鐘，取上清液作為接種物。種物。（3 3）接種物在接種前需做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)，只有無(wú)菌接）接種物在接種前需做細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)，只有無(wú)菌接種物才可進(jìn)一步使用。種物才可進(jìn)一步使用。（4 4）植物樣本經(jīng)剪碎、研磨、離心、過濾后接種植株）植物樣本經(jīng)剪碎、研磨、離心、過濾后接種植株哪些方法可以分離培養(yǎng)病毒？各有什么優(yōu)點(diǎn)？雞胚接種基本原理雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：l雞胚作為病毒的敏感細(xì)胞，

7、能支持病毒完成從吸雞胚作為病毒的敏感細(xì)胞，能支持病毒完成從吸附到基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、裝配、釋附到基因組復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、裝配、釋放的整個(gè)生命過程，從而使得病毒得以增殖。放的整個(gè)生命過程，從而使得病毒得以增殖。接種路徑：羊膜腔，尿囊腔，絨毛尿囊膜，接種路徑：羊膜腔，尿囊腔，絨毛尿囊膜，胚體和卵黃囊接種等胚體和卵黃囊接種等不同的病毒必須采用不同的接種路徑不同的病毒必須采用不同的接種路徑雞胚培養(yǎng)病毒的用途：分離、增殖、毒力測(cè)雞胚培養(yǎng)病毒的用途：分離、增殖、毒力測(cè)定、疫苗制備等。定、疫苗制備等。動(dòng)物病毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞胚多種細(xì)胞培養(yǎng)接種前的準(zhǔn)備雞胚的孵化雞胚的孵化雞胚的活力鑒別雞胚的活力鑒別

8、樣本的前處理樣本的前處理確定采用的接種路徑確定采用的接種路徑本次實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格的無(wú)菌操作本次實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格的無(wú)菌操作實(shí)驗(yàn)步驟1 1、照蛋：、照蛋：活胚：有鮮紅的血管、搖動(dòng)有黑點(diǎn)、黑點(diǎn)運(yùn)動(dòng)活胚：有鮮紅的血管、搖動(dòng)有黑點(diǎn)、黑點(diǎn)運(yùn)動(dòng)靈活。靈活。死胚：血管比較暗、搖動(dòng)時(shí)黑點(diǎn)運(yùn)動(dòng)不靈活死胚：血管比較暗、搖動(dòng)時(shí)黑點(diǎn)運(yùn)動(dòng)不靈活無(wú)精蛋：均勻透明、無(wú)血管和黑點(diǎn)無(wú)精蛋：均勻透明、無(wú)血管和黑點(diǎn)2 2、劃出氣室、劃出氣室 找出血管相對(duì)較少的部位找出血管相對(duì)較少的部位3 3、消毒氣室、消毒氣室 先用碘酊棉球，在用酒精棉球脫碘先用碘酊棉球，在用酒精棉球脫碘4 4、打孔器打孔、打孔器打孔 在氣室的斜上方中心在氣室的斜上方中心5 5、病

9、毒接種、病毒接種 滅菌注射器取滅菌注射器取0.20.2毫升病毒液（毫升病毒液（雞新城雞新城疫病毒的稀釋液？疫病毒的稀釋液？），沿孔垂直插入約），沿孔垂直插入約1.51.5厘米進(jìn)行接種（厘米進(jìn)行接種（尿囊腔接種尿囊腔接種）6 6、石蠟封閉接種孔、石蠟封閉接種孔（石蠟加熱時(shí)溫度不要（石蠟加熱時(shí)溫度不要太高，以防燃燒）太高，以防燃燒）7 7、雞胚培養(yǎng)、雞胚培養(yǎng) 標(biāo)記后，于標(biāo)記后，于3737培養(yǎng)培養(yǎng)48-7248-72小時(shí)。小時(shí)。2424小時(shí)內(nèi)死亡雞胚必須剔除小時(shí)內(nèi)死亡雞胚必須剔除（為什么？如何判定非病毒引起的死亡？）（為什么？如何判定非病毒引起的死亡？）病毒是否有增殖？8 8、下次實(shí)驗(yàn)要驗(yàn)證病毒，觀察雞胚