谷氨酸工藝學(xué)

1、第一章1、什么是氨基酸？氨基酸是含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成動(dòng)物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)。 是含有一個(gè)堿性氨基和一個(gè)酸性羧基的有機(jī)化合物。氨基酸種類與分類 蛋白質(zhì)氨基酸2、工業(yè)生產(chǎn)的主要為蛋白質(zhì)氨基酸，共非蛋白質(zhì)氨基酸20 種3、氨基酸生產(chǎn)方法（ 1 ）發(fā)酵法直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵（ 2 ）化學(xué)合成法（3）酶法（ 4）蛋白質(zhì)水解法4、氨基酸的應(yīng)用醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)、農(nóng)業(yè)、化學(xué)工業(yè)、科學(xué)研究世界上最大的氨基酸消費(fèi)市場(chǎng)是飼料添加劑四大飼料氨基酸：奶酪夾蘇Lys（賴氨酸）、Met （甲硫氨酸）Tyr （酪氨酸）、Th

2、r （蘇氨酸）主要有 4個(gè)方面的功效：促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育；改善肉質(zhì)，提高產(chǎn)奶、產(chǎn)蛋量；節(jié)省蛋白質(zhì)飼料，使飼料得到充分利用；降低成本，提高飼料利用率。5、 1956 年分離到谷氨酸棒狀桿菌6、日本味之素、協(xié)和發(fā)酵、德國Degussa 、山東阜豐集團(tuán)、河北梅花集團(tuán)、寧夏伊品7、存在問題：采取措施：產(chǎn)品附加值低產(chǎn)能嚴(yán)重過剩原料、能源成本高技術(shù)落后，污染嚴(yán)重產(chǎn)能優(yōu)化技術(shù)創(chuàng)新產(chǎn)品創(chuàng)新思想轉(zhuǎn)變第二章淀粉水解糖的制備1、淀粉的組成在偏振光照射下，產(chǎn)生雙折射現(xiàn)象（即“偏光十字”現(xiàn)象）直鏈淀粉水懸浮液加熱時(shí)，不產(chǎn)生糊精，而以膠體狀態(tài)溶解，遇碘反應(yīng)是純藍(lán)色支鏈淀粉膨脹性物質(zhì)，只在加熱加壓下，才溶于水。水中加熱成膠黏

3、狀物，遇碘呈紫紅色2、淀粉的特性：糊化、液化、糖化、老化、3、糊化定義：淀粉在熱水中能吸收水分而膨脹，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成帶有粘性的淀粉糊。4、淀粉糊化的過程第一階段:預(yù)糊化淀粉緩慢地可逆地吸收水分,淀粉顆粒已有些微膨脹第二階段:糊化當(dāng)溫度升到大約65 時(shí) ,淀粉顆粒經(jīng)過不可逆地突然很快地吸收大量水分后,膨脹粘度增加很大，可達(dá)原體積的幾倍到幾十倍第三階段:溶解當(dāng)溫度繼續(xù)升高,淀粉顆粒變成無形空囊,可溶性淀粉浸出透明的均質(zhì)膠體。5、液化：利用液化酶使淀粉糊化，黏度降低，并水解得到糊精和低聚糖的過程6、糖化 :利用糖化酶將淀粉液化產(chǎn)物進(jìn)一步水解成葡萄糖的過程,成為半理論收率：11

4、1.11%實(shí)際收率：僅有105108%7、老化：糊化淀粉又重新排列形成新氫鍵的過程，也是一個(gè)復(fù)結(jié)晶過程。（直鏈易老化）8、淀粉水解糖：工業(yè)上將淀粉水解為葡萄糖的過程為糖化，所制得的糖液稱為淀粉水解糖9、淀粉的生產(chǎn)原理 :利用淀粉不溶于冷水，相對(duì)密度大于水的特性進(jìn)行的物理分離過程過程：原料 - 清理 -浸泡 -粗碎 -胚的分離 -磨碎 -分離纖維 - 分離蛋白 - 清洗 - 離心分離 -干燥 -淀粉10 、谷氨酸生產(chǎn)菌不能直接利用淀粉。11 、淀粉水解的方法酸解法（無機(jī)酸在高溫高壓下催化完成）最早出現(xiàn)酶酸法（酶液化、酸糖化）過濾性能好酸酶法（酸液化、酶糖化）雙酶法（酶催化完成糖化過程）使用專一性

5、很強(qiáng)的淀粉酶和糖化酶為催化劑，將淀粉水解為葡萄糖原料粉碎調(diào)漿液化 滅酶調(diào)整pH 糖化 滅酶中和過濾糖化液12 、雙酶法工藝特點(diǎn)酶專一性高，副產(chǎn)物少，糖液純度高；反應(yīng)條件溫和，不需要耐高溫高壓、耐酸的設(shè)備；可在較高的淀粉濃度下水解，可以使用粗原料；糖液質(zhì)量高；周期長(zhǎng)，設(shè)備多。13 、 - 淀粉酶可以切斷 -1 ， 4糖苷鍵60-70 ；6.0-7.0 穩(wěn)定，Ca2+、 Zn2+ 、 Cl+有激活作用，不能切斷 -1 ， 6糖苷鍵90-110 5.0 以下失活FeSO4、 ZnSO4 、 CuSO4 有抑制作用。糖化酶從非還原性末端切斷 -1 ，4 糖苷40-65 ；最3.0-5.5 穩(wěn) 定 ;鍵

6、； 緩慢切斷 -1， 6 糖苷鍵佳 58-60 最適 4.0-4.514 、 DE 值：表示淀粉水解程度或糖化程度。也稱葡萄糖值。還原糖濃度 ( )100 %DE） 糖液相對(duì)密度（干物質(zhì)濃度（d）15 、DX 值：糖液中葡萄糖含量占干物質(zhì)的百分率。葡萄糖濃度 ( )100 %DE干物質(zhì)濃度（） 糖液相對(duì)密度（d）16 、 DE 值和DX 值的區(qū)別：DE>DX17 、谷氨酸發(fā)酵水解糖的要求1. 嚴(yán)格控制原料質(zhì)量2. 正確控制淀粉乳的濃度3. 水解完全4. 糖液清、色澤淺5. 糖液新鮮6. 降低糖液蛋白質(zhì)的含量18 、水解糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（ 1 ）色澤：淺黃、杏黃通明液體；（ 2 ）糊精反應(yīng)：無

7、；（ 3 ）還原糖含量： 18% 左右（ 4 ） DE 值（葡萄糖值）：90% 以上；（ 5 ）透光率： 60%以上（ 6 ） pH ： 4.6-4.8第三章谷氨酸發(fā)酵機(jī)制1、生成谷氨酸的主要酶促反應(yīng)（ 1）谷氨酸脫氫酶(GHD)所催化的還原氨基化反應(yīng)。主導(dǎo)性反應(yīng)(2) 轉(zhuǎn)氨酶 (AT)催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)GPT 則以肝臟中活力最大測(cè)定GOT 活力則有助于對(duì)心臟病變的診斷(3) 谷氨酸合成酶 (Gs) 催化的反應(yīng)2、三種生成谷氨酸的酶促反應(yīng)的共同點(diǎn)：以 -酮戊二酸為前體3、由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑5 個(gè)：TCA 循環(huán)、 EMP 途徑、 HMP 途徑、乙醛酸循、丙酮酸梭化支路（ CO2 固定）

8、，至少 16步酶促反應(yīng)。4、谷氨酸生物合成的理想途徑谷氨酸對(duì)葡萄糖的質(zhì)量理論轉(zhuǎn)化率為：實(shí)際轉(zhuǎn)化率：處于二者之間，即81.7%54.4% 81.7%(1) 葡萄糖首先經(jīng)EMP及HMP兩個(gè)途徑生成丙酮酸。以EMP為主，HMP約占26% 。(2)生成的丙酮酸：一部分在丙酮酸脫氫酶系的作用下氧化脫羧生成乙酰另一部分經(jīng)CO2 固定反應(yīng)生成草酰乙酸或蘋果酸。CoA，(3) 草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，檸檬酸在順烏頭酸酶的作用下生成異檸檬酸，異檸檬酸再在異檸檬酸脫氫酶的作用下生成 -酮戊二酸， -酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前體。(4) -酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶

9、作用下經(jīng)還原氨基化反應(yīng)生成谷氨酸5、控制谷氨酸合成的重要措施(1) -酮戊二酸氧化能力微弱，即 -酮戊二酸脫氫酶活力微弱(2) 谷氨酸脫氫酶活性強(qiáng)(3) 細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性高6、谷氨酸高產(chǎn)菌種特點(diǎn)：谷氨酸產(chǎn)生菌應(yīng)喪失或僅有微弱的 -酮戊二酸脫氫酶活力，使 - 酮戊二酸不能繼續(xù)氧化谷氨酸脫氫酶活力很強(qiáng)，同時(shí)NADPH H再氧化能力弱，使到琥珀酸的反應(yīng)受阻，在過量NH4+ 存在時(shí)，經(jīng)氧化還原共軛的氨基化反應(yīng)而生成谷氨酸生成的谷氨酸不形成蛋白質(zhì)而分泌到菌體外谷氨酸產(chǎn)生菌大多為生物素缺陷型，谷氨酸發(fā)酵時(shí)通常控制生物素亞適量，引起代謝失調(diào)，使谷氨酸得以積累7、谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制優(yōu)先合成由于 -

10、 酮戊二酸脫氫酶活性微弱，谷氨酸脫氫酶的活力很強(qiáng)，優(yōu)先合成谷氨酸反饋調(diào)節(jié)反饋?zhàn)瓒艮D(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)慢，反饋抑制酶活性水平調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)快。（ 1 ）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的調(diào)節(jié)（ 2）檸檬酸合成酶的調(diào)節(jié)（ 3）異檸檬酸脫氫酶的調(diào)節(jié)（ 4） -酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)（ 5）谷氨酸脫氫酶的調(diào)節(jié)糖代謝調(diào)節(jié)糖分解代謝包括酵解與三羧酸循環(huán)；（提供能量）合成代謝包括糖的異生、糖原與結(jié)構(gòu)多糖的合成等，中間代謝還有磷酸戊糖途徑、糖醛酸途徑等。（消耗能量）糖代謝的調(diào)節(jié)主要受能荷控制能荷：細(xì)胞所處的能量狀態(tài)用 ATP、ADP 和 AMP 之間的關(guān)系來表示， 稱為能荷 (energy charge) 。能荷計(jì)算

11、公式為：ATP 全部轉(zhuǎn)化為AMP 時(shí)，能荷值為0AMP 全部轉(zhuǎn)化為ATP 時(shí)，能荷值為1多數(shù)細(xì)胞的能荷為0.80 0.95能荷低激活糖代謝的酶能荷高抑制糖代謝的酶氮代謝調(diào)節(jié)：控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，成其它氨基酸和參與蛋白質(zhì)的合成使合成的谷氨酸不去轉(zhuǎn)化8、生物素的調(diào)節(jié)生物素：生物素（Biotin ）為B 族維生素之一，又稱維生素H、維生素B7、輔酶R）等。是羧化酶的輔基，引起固碳作用及羧基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，參與糖和脂肪的代謝。生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)3 個(gè)（ 1）生物素對(duì)糖代謝速率的影響R（Coenzyme主要是影響糖酵解的速率，而不是影響EMP與HMP途徑的比率。生物素充足,加快

12、了糖代謝,提高了（ 2）生物素對(duì)NADH 的數(shù)量，使丙酮酸生成乳酸，乳酸得到積累CO2 固定的影響生物素是丙酮酸羧化酶的輔酶，參與CO2固定反應(yīng)。生物素過量時(shí)CO2固定反應(yīng)可增強(qiáng)（ 2）生物素對(duì)乙醛酸循環(huán)的影響乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶為異檸檬酸裂解酶。異檸檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，所誘導(dǎo)。以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，通過控制生物素亞適量，使乙酸生成少不到異檸檬酸裂解酶的活性，所以在生物素亞適量條件下，乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，被乙酸,幾乎看代謝流向異檸檬酸、 -酮戊二酸、谷氨酸的方向高效移動(dòng)生物素對(duì)氮代謝的調(diào)節(jié)在生物素亞適量時(shí)，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶、琥珀酸氧化能力弱、蘋果酸和草酰乙酸脫羧

13、反應(yīng)停滯，同時(shí)又由于完全氧化降低的結(jié)果，使ATP 生成量減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成活動(dòng)停滯生物素對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響：生物素是催化脂肪酸合成起始反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA 羧化酶的輔酶，對(duì)脂肪酸的形成起促進(jìn)作用。 選育生物素缺陷型菌株，阻斷生物素合成，亞適量控制生物素添加，抑制不飽和脂肪酸的合成，使得細(xì)胞膜不完整，提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。9、控制細(xì)胞膜通透性的方法主要有兩種：一種是通過控制脂肪酸和甘油的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷脂合成的控制，使得細(xì)胞不能形成完整的細(xì)胞膜；(1) 利用生物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度。生物素參與了脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響了磷脂的合成和細(xì)胞膜的形成

14、。(2) 利用生物素過量的糖蜜原料進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，添加表面活性劑或飽和脂肪酸。這些物質(zhì)對(duì)生物素起拮抗作用， 抑制不飽和脂肪酸的合成， 導(dǎo)致油酸合成量減少，使得細(xì)胞膜不完整， 提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。 常用的表面活性劑有吐溫常用的飽和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。磷脂合成不足，-60、吐溫 -40 等。(3) 利用油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基油酸的濃度。油酸缺陷型菌株喪失了自身合成油酸的能力，直接影響磷脂的合成，不能形成完整細(xì)胞膜，當(dāng)油酸過量時(shí)， 該菌株只長(zhǎng)菌或產(chǎn)酸少； 當(dāng)油酸亞適量時(shí)，隨著油酸的耗盡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，使得谷氨酸的通透性提高。(4) 利用甘油缺陷型

15、菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基甘油的濃度。甘油缺陷型菌株不能自身合成 - 磷酸甘油和磷脂，外界供給甘油才能使其生長(zhǎng)，因此可以通過控制甘油添加量來控制細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。當(dāng)甘油添加量過多時(shí)，磷脂正常合成，菌體正常生長(zhǎng)，不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸低；當(dāng)甘油添加量過少時(shí)，菌體生長(zhǎng)不好，產(chǎn)酸低，所以控制甘油亞適量是控制的關(guān)鍵。(5) 利用溫度敏感突變株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，發(fā)酵采用變溫發(fā)酵模式溫度敏感突變株的作用機(jī)制是涉及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的酶在高溫時(shí)失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜機(jī)發(fā)生改變。一種是通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使得細(xì)胞不能形成完整的細(xì)胞壁，喪失了對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用。膜內(nèi)外滲透壓差等因素影響下，細(xì)胞膜物理性損傷，增大膜的通

16、透性對(duì)細(xì)胞壁形成的控制方法：添加青霉素、頭孢霉素C 等 -內(nèi)酰胺類抗生素。在10 、銨離子對(duì)谷氨酸合成有和作用？在 NH4+ 適量存在下，積累谷氨酸，生成的谷氨酸也不通過轉(zhuǎn)氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白質(zhì)NH4+ 進(jìn)一步過剩供給時(shí)，發(fā)酵液偏酸性，pH 在 5.5 6.5 ，谷氨酸會(huì)進(jìn)一步生成谷氨酰胺在生物素充足的條件下,蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，造成谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成其它氨基酸量增加在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，生物素缺陷型菌在不存在時(shí)，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是NH4+ 存在時(shí)，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高； - 酮戊二酸、丙酮酸等物質(zhì)，不產(chǎn)生谷氨酸NH4+第四章谷氨酸生產(chǎn)菌的特征、

17、育種及擴(kuò)大培養(yǎng)1、谷氨酸生產(chǎn)菌株應(yīng)該具有什么普遍性的特點(diǎn)(1) 高產(chǎn)菌株特點(diǎn)1）都是生物素缺陷型2）谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)（檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸酶）3） - 酮戊二酸脫氫酶活力弱4）具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力（細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性高）(2) 代謝特征5）二氧化碳固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)6）乙醛酸循環(huán)弱（異檸檬酸裂解酶活力弱）7）三羧酸循環(huán)不完整（NADPH2 進(jìn)入呼吸鏈能力弱）8）都是需氧型微生物(2) 底物利用9）不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白等10 ）能分解尿素為氨（脲酶強(qiáng)陽性）11 ）不分解利用谷氨酸12 ）能利用醋酸，不能利用石蠟(4) 生理生化特征13 ）細(xì)胞形態(tài)為球形、棒形

18、以至短桿形14 ）革蘭氏染色陽性，無芽孢，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)15 ) 發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯變化，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性變化2、谷氨酸生產(chǎn)菌主要：棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌。3、國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌（ 1）北京棒桿菌（As1.299 ）（ 2）鈍齒棒桿菌（ As1.542 ）細(xì)胞大、后提取容易，收率較高，質(zhì)量較好（ 3）天津短桿菌（ T613 ）4、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的過程斜面菌種一級(jí)種子培養(yǎng)（三角瓶） 二級(jí)種子培養(yǎng)（小型發(fā)酵罐發(fā)酵罐5、氨基酸生產(chǎn)菌一般用二級(jí)種子培養(yǎng)6、影響種子質(zhì)量的主要因素種子質(zhì)量的優(yōu)劣取決于:菌種本身和培養(yǎng)條件(一 )培養(yǎng)基構(gòu)成營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。（二）溫

19、度種子生長(zhǎng)最適溫度,避免波動(dòng)大。（三） pH種子的pH 比較穩(wěn)定，前不宜高，后不宜低（四）通氣量（溶氧量）應(yīng)前低后高在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，五）接種量有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)。但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵。過大 會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成，而且會(huì)過多移入代謝廢物，不經(jīng)濟(jì)過小 會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，影響種子活力，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。（六）種齡種齡：種子的培養(yǎng)時(shí)

20、間通常種齡是以處于生命力極旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量還未達(dá)到最大值時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間較為合適。時(shí)間太長(zhǎng)，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長(zhǎng)緩慢在發(fā)酵生產(chǎn)中，種子培養(yǎng)時(shí)間不宜太長(zhǎng)，一般都選在生命力極為旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以7-8h 為好。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的， 一般需經(jīng)過多種實(shí)驗(yàn)來確定。比如，嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12 小時(shí)最好。7、種子擴(kuò)大培養(yǎng)的質(zhì)量要求1斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長(zhǎng)而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對(duì)純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以 多含有機(jī)氮而少含糖為原則。培養(yǎng)條件：33-34

21、，培養(yǎng)18-24h斜面一般只移接三代2一級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)為主，培養(yǎng)條件從的 目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮有利于長(zhǎng)菌考慮。一級(jí)種子質(zhì)量要求C低 N高種齡： 12hpH 值： 6.4 ± 0.1光密度：凈增OD 值 0.5以上殘?zhí)牵?.5 以下無菌檢查： (-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長(zhǎng)均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反應(yīng)。3二級(jí)種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級(jí)種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級(jí)種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。二級(jí)種子的質(zhì)量要求種齡7-8hpH7.2 左右OD 值凈增0.5 左右殘?zhí)窍?/p>

22、耗1%左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)革蘭氏染色陽性反應(yīng)8、發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)9、谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài)1. 發(fā)酵前期感染噬菌體的菌體形態(tài)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞不規(guī)則，發(fā)圓，發(fā)胖，有明顯的細(xì)胞碎片，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng)互相堆在一起,幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞,類似蛛網(wǎng)或魚翅狀。生產(chǎn)上表現(xiàn)：排氣口二氧化碳迅速下降，OD 值下跌，耗糖緩慢等。2. 發(fā)酵中后期感染噬菌體的菌體形態(tài)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，有的邊緣似乎有毛刺狀的東西，有細(xì)胞碎片。生產(chǎn)上表現(xiàn)： OD 值下降，泡沫多，黏度大，耗糖緩慢。及時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)物，大多可完成發(fā)酵。10 、谷氨酸的育種大致可分為三類：代謝控制育種、誘變育

23、種、生物工程新技術(shù)選育：原生質(zhì)體融合法、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、重組DNA 技術(shù)11 、谷氨酸生產(chǎn)菌的具體育種思路1.切斷或減弱支路代謝2.解除自身的反饋抑制3.增加前體物的合成4.提高細(xì)胞膜的滲透性5.強(qiáng)化能量代謝6.抗逆性強(qiáng)的菌株12 、選育菌株1 、選育耐受高滲透壓的菌種2 、選育不利用谷氨酸的突變株3 、選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株4 、選育強(qiáng)化 CO2 固定反應(yīng)的突變株5 、選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株6 、選育強(qiáng)化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到 - 酮戊二酸代謝的突變株7 、選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株8 、選育強(qiáng)化能量代謝的突變株9 、選育減弱 HMP 途徑后段酶活性的突變株13 、應(yīng)用

24、原生質(zhì)體融合新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌原生質(zhì)體：動(dòng)植物和微生物細(xì)胞去除細(xì)胞壁以后的一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)就是把兩個(gè)親本的細(xì)胞分別去掉細(xì)胞壁， 獲得原生質(zhì)體， 將兩親本的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇（ PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細(xì)胞質(zhì)融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實(shí)現(xiàn)遺傳重組。原生質(zhì)體雜交的一般步驟標(biāo)記菌株的篩選（抗性）原生體的制備（去除細(xì)胞壁）溶菌酶 溶解掉細(xì)菌的細(xì)胞壁，同時(shí)須在高滲環(huán)境中進(jìn)行原生質(zhì)體的融合（40%PEG 促融）細(xì)胞壁再生（涂布在能使細(xì)胞壁再生的培養(yǎng)基上）融合子的選擇（選擇性培養(yǎng)基）實(shí)用性菌株的篩選14 、應(yīng)用轉(zhuǎn)化法選育谷氨酸生產(chǎn)菌轉(zhuǎn)化（ Transforma

25、tion）,是指受體細(xì)胞直接吸收了來自供體細(xì)胞的DNA 片段 ,并將它整合到自己的基因組中,從而獲得了供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。感受態(tài)細(xì)胞：凡能吸收外源DNA 片段并能將其整合到自己的染色體組中以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞,15 、應(yīng)用轉(zhuǎn)導(dǎo)法選育谷氨酸生產(chǎn)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)（ Transduction ）：通過溫和噬菌體為媒介，將供體細(xì)胞中的DNA攜帶到受體細(xì)胞中，使受體細(xì)胞獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象。16 、應(yīng)用重組DNA 重組技術(shù)構(gòu)建谷氨酸工程菌株第五章谷氨酸發(fā)酵過程控制1、氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵2、谷氨酸發(fā)酵的發(fā)酵轉(zhuǎn)換3、谷氨酸發(fā)酵過程控制的目的：發(fā)酵條件最優(yōu)化，生產(chǎn)能力最大化。4、影響谷氨酸

26、發(fā)酵外部因素培養(yǎng)基組成：碳源作用：碳源是供給菌體生命活動(dòng)所需的能量構(gòu)成菌體細(xì)胞合成谷氨酸氮源作用：合成蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)合成產(chǎn)物谷氨酸氨基調(diào)節(jié)pH一般加入尿素或液氨。連續(xù)生產(chǎn)中液氨比尿素更好。谷氨酸發(fā)酵需氮源比一般工業(yè)發(fā)酵高無機(jī)鹽作用：構(gòu)成菌體、酶的組成部分、酶的抑制或激活劑、調(diào)節(jié)滲透壓、調(diào)節(jié)化還原電位。主要的無機(jī)鹽：P、 Mg 、 K、 Fe、 Mn 等有害金屬：Cu、 Hg 、 Co 等生長(zhǎng)因子：凡是微生物生長(zhǎng)不可缺少的，微生物自身不能合成的微量有機(jī)物質(zhì)。生長(zhǎng)因子的來源（1）玉米漿（2）麩皮（3 ）糖蜜（4 ）酵母pH值和氧溫度酶活改變生物合成途徑，使代謝產(chǎn)物發(fā)生變化改變發(fā)酵液物理性質(zhì)

27、影響菌種對(duì)營養(yǎng)物的分解與吸收生長(zhǎng)期（0-12 h ）30-34產(chǎn)酸期（12 h 以后） 35-37pH尿素分解pH ，氨被利用pH ，加入尿素，產(chǎn)酸 ，反復(fù)直到結(jié)束。酶的活性。影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷，改變細(xì)胞膜的滲透性。影響物質(zhì)分解速率，影響微生物對(duì)培養(yǎng)基物質(zhì)的吸收利用。改變菌體代謝途徑，使代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。細(xì)菌最適生長(zhǎng)pH 6.5 7.5 ；霉菌一般為pH4.0 5.8 ；酵母為pH3.8 6.0 。谷氨酸產(chǎn)生菌的最適生長(zhǎng)pH6.5 8.0pH 變化為：前期7.3太低只長(zhǎng)菌，不產(chǎn)酸太高不利菌生長(zhǎng)中期 7.2, 后期7.0太低 -酮戊二酸太高生成谷氨酰胺pH調(diào)節(jié)方式添加碳酸鈣尿素流加液氨流加

28、用量大，易染菌，除去難不同菌種流加方式不同適于連續(xù)流加溶氧臨界溶解氧濃度好氣微生物對(duì)培養(yǎng)液中溶解氧濃度的最低要求，在某一濃度以下，微生物的呼吸速率隨溶氧降低而顯著下降，此溶解氧濃度稱為臨界溶解氧濃度在長(zhǎng)菌體階段，通風(fēng)量過小, PL P 臨界 ,微生物生長(zhǎng)受到抑制;通風(fēng)過大，生物素缺乏，抑制菌體生長(zhǎng)。高氧水平會(huì)造成浪費(fèi)，在高氧水平下生長(zhǎng)的菌體不能有效地合成谷氨酸。在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，需要大量通風(fēng)供氧，以防生成乳酸和琥珀酸，但過大通風(fēng)，則大量積累a-酮戊二酸。5、發(fā)酵中控制CO2 濃度為13% 左右6、 CO2 是發(fā)酵控制染菌的重要指標(biāo)染噬菌體下降染雜菌上升7、泡沫對(duì)發(fā)酵的影響1 、降低生產(chǎn)能力2、引

29、起原料浪費(fèi)3、影響菌的呼吸4、引起染菌8、發(fā)酵過程泡沫形成的規(guī)律（ 1）通氣攪拌的強(qiáng)烈程度通氣大、攪拌強(qiáng)烈可使泡沫增多（ 2）培養(yǎng)基配比與原料組成培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，黏度大，產(chǎn)生泡沫多而持久，前期難開攪拌。（ 3）菌種、種子質(zhì)量和接種量菌種質(zhì)量好，生長(zhǎng)速度快，可溶性氮源較快被利用，泡沫產(chǎn)生幾率也就少。（ 4）滅菌質(zhì)量培養(yǎng)基滅菌質(zhì)量不好，糖氮被破壞，抑制微生物生長(zhǎng)，使種子菌絲自溶，產(chǎn)生大量泡沫，加消泡劑也無效。9、消泡的方法：物理方法、機(jī)械方法化學(xué)消泡破泡作用、抑泡作用。天然油脂類；高碳醇、脂肪酸和脂類；聚醚類谷氨酸發(fā)酵硅酮類10 、發(fā)酵過程中主要變化及中間代謝控制1、適應(yīng)期：發(fā)酵初期種子剛接入發(fā)酵

30、罐，菌體處于適應(yīng)期，此時(shí) 糖基本不耗或很少消耗，由于初尿分解放出氨，pH 稍微上升。適應(yīng)期的長(zhǎng)短取決于菌種活力、種子量、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件等。措施：接種量和發(fā)酵條件控制使期縮短。2. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(3-8 或 4-10h)OD值直線增長(zhǎng)，菌種V 字形排列耗糖速度加快必須流加尿素溫度上升，注意降溫排氣中二氧化碳濃度顯著增加耗氧量很快增加，培養(yǎng)液中的溶解氧下降措施：及時(shí)供給菌體生長(zhǎng)必須的氮源及調(diào)節(jié)pH， 在 pH7.5-8.0時(shí)流加尿素；維持溫度30-32 ， 對(duì)數(shù)末期要加大風(fēng)量3. 轉(zhuǎn)化期（8-14h 或 10-18h ）生物素含量有豐富轉(zhuǎn)向貧乏，部分菌體停止繁殖，在條件適宜時(shí)開始伸長(zhǎng)、膨脹，

31、形成生產(chǎn)型細(xì)胞，開始積累谷氨酸.這時(shí) 菌體數(shù)量達(dá)最大，代謝最旺盛，耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加，耗 氧速率加快并接近最大值，放熱也達(dá)最大值，且泡沫顯著增加發(fā)酵控制方面充分供氧，風(fēng)量達(dá)最大值，充分供給氮源，注意冷卻降溫。此時(shí)以前的控制是發(fā)酵成敗之關(guān)鍵生物素用量和供氧巧妙的配合4. 產(chǎn)酸期大量累積谷氨酸，耗糖與產(chǎn)酸相適應(yīng)，產(chǎn)酸達(dá)最大值，對(duì)糖轉(zhuǎn)化率達(dá)有充足的氮源，pH 值維持7.0-7.2 。為加快產(chǎn)酸速率，提高溫度到36-37 。在發(fā)酵后期可適當(dāng)降低風(fēng)量，流加尿素以少量為好，控制當(dāng)殘?zhí)堑?% 時(shí)，將風(fēng)量降到最低，促進(jìn)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成谷氨酸5、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?。措施：營養(yǎng)物耗盡酸濃度

32、不增加時(shí)，及時(shí)放罐。發(fā)酵周期一般為30h 。pH值6.8-7.050-60%，應(yīng)繼續(xù)流加尿素，保證11 、強(qiáng)制發(fā)酵：指人為強(qiáng)制控制發(fā)酵條件（生物素含量和菌體生長(zhǎng)）的發(fā)酵方法。12 、糖蜜分為：甘蔗糖蜜(cane molasses)甜菜糖蜜(beet molasses)除膠體中和（石灰）、H2SO4除鈣鹽加入 Na 2CO313 、發(fā)酵方法：1、采用耐生物素的油酸、甘油缺陷型和溫度敏感型菌種。2、添加青霉素適當(dāng)阻止細(xì)胞壁合成。3、添加表面活性劑以增加細(xì)胞膜透性。14 、影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵吐溫添加的時(shí)間和濃度4-5 小時(shí) , OD=0.11-0.13添加量0.2-0.22% 。15 、工藝條件及控制要

33、點(diǎn)種子培養(yǎng)基C低N高接種量控制在8-10%發(fā)酵應(yīng)控制在6.5-7.0溫度控制1-12 h30-33（WTH-1菌株）12-24 h 33-3424-36 h 34-35風(fēng)量的控制梯形通風(fēng)控制、先3或4級(jí)提風(fēng)，維持 10h再 3 或 4 級(jí)降風(fēng)。實(shí)現(xiàn)排氣中CO2 含量恒定(13% 左右 )。放罐前2h ，殘?zhí)菫?.3% 左右，降低通風(fēng)，利用殘余酶的作用將殘?zhí)墙禐?6 、甘蔗糖蜜添加青霉素流加糖發(fā)酵工藝添加青霉素的時(shí)間與濃度是關(guān)鍵。“三高”強(qiáng)制發(fā)酵工藝(即 高生物素、大接種量、高青霉素) 與高濃度流加糖工藝17 、發(fā)酵30h ，產(chǎn)酸120g/L ，糖酸轉(zhuǎn)化率60%低糖流加工藝及后期高糖補(bǔ)加0.6%

34、以下。,以提高產(chǎn)率第七章 噬菌體與雜菌的防治1、谷氨酸發(fā)酵噬菌體感染率1 2。2、噬菌體污染的異?，F(xiàn)象“二高三低”pH 高、殘?zhí)歉逴D 低、溫度低、產(chǎn)酸低3、取防治結(jié)合、以防為主、防重于治使用抗性菌株利用藥物和凈化環(huán)境等其中采用菌株管理和環(huán)境凈化為中心的綜合防治措施，是根本的防治方法4、谷氨酸發(fā)酵污染噬菌體后的挽救并罐法輪換使用菌種或使用抗性菌株放罐重消法罐內(nèi)滅噬菌體法5、發(fā)酵生產(chǎn)染菌的原因空氣質(zhì)量差設(shè)備出現(xiàn)滲漏滅菌操作失誤接種操作失誤移種操作失誤6、染菌檢查檢查凈化空氣檢查培養(yǎng)基和培養(yǎng)物檢查發(fā)酵罐檢查管道的污染隱患檢查無法直接觀察的設(shè)備部件染菌隱患第八章 谷氨酸的提取1、谷氨酸提取工藝的原則：1、工藝簡(jiǎn)單，操作方便；2、所用原材料價(jià)格低廉，來源豐富；3、提取收率高，產(chǎn)品純度高；4、勞動(dòng)強(qiáng)度??；5、設(shè)備簡(jiǎn)單，造價(jià)低；6、注意盡量不造成或減少對(duì)環(huán)境的污染2、將谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵液中積累的L-谷氨酸提取出來,再進(jìn)一步中和、除鐵、脫色、加工精制成谷氨酸單鈉鹽（味精）的過程稱為谷氨酸提煉。3、谷氨酸在等電點(diǎn)時(shí)，即pH3.224、低溫等電點(diǎn)法提取谷氨酸5、