應用微生物學試驗

1、應用微生物學實驗作者:日期:實驗一、酸奶生產(chǎn)菌的分離純化及應用一、實驗目的和內(nèi)容了解乳酸菌的生長特性，學習乳酸發(fā)酵和制作乳酸菌飲料的方法。內(nèi)容包括：1 .從新鮮酸乳中進行乳酸菌的分離純化；2 .乳酸菌飲料制作；3 .自制乳酸飲料質(zhì)量的品嘗。二、原理酸奶是采用優(yōu)質(zhì)純鮮牛奶加入白糖均質(zhì)， 經(jīng)超高溫滅菌后接入乳酸菌發(fā)酵后制成的一種發(fā)酵型乳制品，具備鮮奶的全部營養(yǎng)成分，含有人體必需的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、乳糖酶和活性乳酸菌等。在發(fā)酵過程中，鮮牛奶中的酪蛋白遇酸凝固，成為有彈性的凝塊，顏色乳白、氣味清香、酸甜可口，別具一番風味。乳酸菌具有把奶類中的乳糖轉(zhuǎn)化成乳酸的功能，稱為乳酸發(fā)酵。在形成乳酸的

2、同時也產(chǎn)生其他一些酸類物質(zhì)， 從而導致了 pH 值的下降，當達到乳類蛋白質(zhì)的等電點時（如牛奶蛋白質(zhì)的等電點約在 pH4.5 左右） ， 引起蛋白質(zhì)的沉淀，使原來流動性較大的乳類，因凝固作用而變成類似果凍的膠狀物，稱之為“凝乳”c不管是何種酸奶，其共同的特點都是含有乳酸菌。這些乳酸菌在人體的腸道內(nèi)繁殖時會分泌對人體健康有益的物質(zhì)，因此酸奶對人體有較多的好處：一是能將牛奶中的乳糖和蛋白質(zhì)分解，使人體更易消化和吸收；二是酸奶有促進胃液分泌、提高食欲、加強消化的功效；三是乳酸菌能減少某些致癌物質(zhì)的產(chǎn)生，因而有防癌作用；四是能抑制腸道內(nèi)腐敗菌的繁殖，并減弱腐敗菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生的毒素；五是有降低膽固醇的作用

3、，特別適宜高血脂的人飲用。和普通牛奶相比，酸奶的最大特點是含有大量活著的微生物，是具有生命力“活”著的特殊食品。酸奶中的微生物根據(jù)它們功能分為 2 大類：1 .發(fā)酵用乳酸菌：是指那些起源于奶制品長期用于酸奶制造的乳酸菌。2 .生物活性用乳酸菌：是近年從人體分離、馴化而成具有特定生物活性的乳酸菌，基本都是后述的益生菌。發(fā)酵用乳酸菌主要用途是決定酸奶風味及口感，關(guān)系到酸奶本身的商品價值。生物活性用乳酸菌是用于強化酸奶營養(yǎng)價值，使它具有某些傳統(tǒng)酸奶所不具備的生理功能，滿足人們健康上的特殊需要。由于現(xiàn)存的生物活性用乳酸菌(益生菌)的大多數(shù)因是來自人體，在牛奶里生長發(fā)育緩慢，代謝產(chǎn)物除了乳酸以外還有其他

4、多種揮發(fā)性物質(zhì)，風味上差強人意。因此多數(shù)情況下，都是同時混合利用這 2 類乳酸菌。在實驗室中可以用“稀釋涂布平板法”“平板劃線法”來分離細菌。 通常培養(yǎng)后通過觀察細菌的菌落可以辨別是哪種細菌，也可以在培養(yǎng)基中加入特定的染色試劑使特定的細菌染色來觀察。三、實驗材料和用具嗜 熱 乳 酸 鏈 球 菌 (Streptococcusthermophilus), 保 加 利 亞 乳 酸 桿 菌(Lactobacillusbulgaricus),乳酸菌種也可以從市場銷售的各種新鮮酸乳或酸乳飲料中分離。BCG 牛乳培養(yǎng)基，乳酸菌培養(yǎng)基，脫脂乳試管，脫脂乳粉或全脂乳粉，鮮牛奶，蔗糖，碳酸鈣。恒溫水溶鍋， 酸度計

5、， 高壓蒸汽滅菌鍋， 超凈工作臺， 培養(yǎng)箱， 酸乳瓶(200280mL,),培養(yǎng)皿，試管，300mL 三角瓶。BCG 牛乳培養(yǎng)基：(A)溶液：脫脂乳粉 100g,水 500ml,加入 1.6%澳甲酚綠(B.C.G)乙醇溶液 1mL,80c滅菌 20min。(B)溶液：酵母膏 10g,水 500mL，瓊脂 20g,pH6.8,121c 濕熱滅菌 20min。以無菌操作趁熱將(A)、(B)溶液混合均勻后倒平板。乳酸菌培養(yǎng)基(CMRS):蛋白陳 5g；牛肉膏 5g;酵母浸膏 2.5g;乳糖 7.5g；土溫 800.5ml；磷酸氫二鉀 1g;乙酸鈉 2.5g;檸檬酸二俊 1g;七水硫酸鎂 0.1g;四

6、水硫酸鈕 0.1g;番茄汁 50ml；瓊脂條 9g；加入 500ml 蒸儲水中加熱溶解，調(diào) pH 值為 6.8,115C,滅菌 15 分鐘。脫脂乳試管：直接選用脫脂乳液或按脫脂乳粉與 5%蔗糖水為 1:10 的比例配制，裝量以試管的 1/3 為宜，115c 滅菌 15min三、操作步聚（一）乳酸菌的分離純化1 .分離取市售新鮮酸乳或泡制酸菜的酸液稀釋至 10-5,取其中的 10-4,10-52 個稀釋度的稀釋液各 0.10.2mL,分別接入 BCG 牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上，用無菌涂布器依次涂布，或者直接用接種環(huán)蘸取原液平板劃線分離， 置 40c 培養(yǎng) 48h,如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培

7、養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。2 .鑒別選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中，40c 培養(yǎng) 824h,若牛乳出現(xiàn)凝固、無氣泡、呈酸性，涂片鏡檢細胞桿狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種均分別選入）,革蘭氏染色呈陽性，則可將其連續(xù)傳代 46 次，最終選擇出在 36h 能凝固的牛乳管，作菌種待用。（二）乳酸菌菌種制備選取凝乳作用較好的乳酸菌典型菌落， 分別轉(zhuǎn)至脫脂乳試管中 （每種菌 2 管） ，40c培養(yǎng) 824h,作為菌種。（三）乳酸菌飲料的制作1 .將脫脂乳粉和水以 1:710（W/W）的比例（或者采用鮮奶）,同時加入 5%-6%蔗糖，充分混合，于 8085c 滅菌 105min,然后冷卻至 3540C,

8、作為制作飲料的培養(yǎng)基質(zhì)。2 .將純種嗜熱乳酸鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌以及兩種菌的等量混合菌液作為發(fā)酵劑，均以 2%5%的接種量分別接入以上培養(yǎng)基質(zhì)中（亦可以市售鮮酸乳為發(fā)酵劑）接種后搖勻，分裝到已滅菌的酸乳瓶中，每一種菌的飲料發(fā)酵液重復分裝 35 瓶，隨后將瓶蓋擰緊密封。3 .把接種后的酸乳瓶置于 40-42。叵溫箱中培養(yǎng) 34h,培養(yǎng)時注意觀察，在出現(xiàn)凝乳后停止培養(yǎng)。然后轉(zhuǎn)入 45c 的低溫下冷藏 24h 以上。經(jīng)此后熟階段，達到酸乳酸度適中（pH44.5）,凝塊均勻致密，無乳清析出、無氣泡、獲得較好的口感和特有風味。4 .品嘗評定酸乳質(zhì)量：采用乳酸球菌和乳酸桿菌等量混合發(fā)酵的酸乳與單菌株發(fā)

9、酵的酸乳相比較，前者的香味和口感更佳。品嘗時若出現(xiàn)異味，表明酸乳污染了雜菌。比較項目按表 1.四、注意事項1.采用 BCG 牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選乳酸菌時，注意挑取典型特征的黃色菌落，結(jié)合鏡檢觀察，有利高效分離篩選乳酸菌。2.制作乳酸菌飲料，應選用優(yōu)良的乳酸菌。采用乳酸球菌與乳酸桿菌等量混合發(fā)酵，使其具有獨特風味和良好口感。3.牛乳的消毒應掌握適宜溫度和時間，防止長時間采用過高溫度消毒而破壞酸乳風味。4.作為衛(wèi)生合格標準還應按衛(wèi)生部規(guī)定進行檢測，如大腸菌群檢測等。經(jīng)品嘗和檢驗，合格的酸乳應在 4c 條件下冷藏，可保存 67d。五、實驗報告1.將發(fā)酵的酸乳品評結(jié)果記錄于表 1 中;表 1 乳酸菌

10、單菌及混合菌發(fā)酵的酸乳品評結(jié)果品評項目球菌桿菌球菌桿菌混合（1:1）凝乳情況口感香味異味pH 值結(jié)論六思考題1、發(fā)酵酸乳為什么能引起凝乳？2、為什么采用乳酸菌混合發(fā)酵的酸乳比單菌發(fā)酵的酸乳口感和風味更佳？3、試設計一個從市售鮮酸乳中分離純化乳酸菌，經(jīng)擴大培養(yǎng)制成直投式凍干菌種的程序。實驗二食用菌的組織分離一、目的和要求掌握了解食用菌組織分離的方法和實際操作技術(shù)， 明確食用菌組織分離在食用菌生產(chǎn)中的重要性。二、原理用子實體（子實體為真菌的產(chǎn)生抱子的生殖體，一般稱為擔抱子體，但對子囊菌和擔子菌來說，如子囊果、擔子果那樣而分別由菌絲組織構(gòu)成的各種形狀的，特稱為子實體。）的某一部分來分離菌種的方法，稱

11、為組織分離法。組織分離法簡便，后代不易發(fā)生變異，能保持原菌株的優(yōu)良特性。組織分離法是利用菇類組織塊能再生成菌絲的特性獲得純種的一種簡捷方法，是野外采集菌種和食用菌栽培中防止品性退化，保持優(yōu)良品種特性常用的一種手段。此法適宜多數(shù)食用菌，是野外工作者和種菇專業(yè)戶必須掌握的一種方法。組織分離最好采用正處于旺盛生長中的幼嫩子實體或菇蕾作為分離材料，采取菌蓋與菌柄交接處的組織進行分離，效果最好，對于那些有內(nèi)或外菌幕保護的菇類來說,取在菌幕保護下的幼嫩菌褶接種，生活力更加旺盛。對于某些菌根菌，則取用靠近基部的菌柄組織才能成活。在食用菌生產(chǎn)中，采用組織分離的方法繁殖母種是大多數(shù)菌類普遍采用的方法。而組織分離

12、成功與否是與種菇子實體的選擇、分離過程中的操作方法等分不開的，這直接關(guān)系到所繁菌種的優(yōu)劣。因此食用菌組織分離是食用菌生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)之一。三、材料和用具培養(yǎng)皿；試管斜面培養(yǎng)基；平菇、金針菇或蘑菇較成熟的子實體；酒精燈，接種針，75%酉精，甲醛；高鈕酸鉀；新潔爾滅消毒液以及溫箱；冰箱等。PDA 培養(yǎng)基： （注：取去皮馬鈴薯 200 克，切成小塊，加水 1000 毫升煮沸 30 分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至 1000 毫升，加葡萄糖 20 克，瓊脂 15 克,溶化后分裝，121度滅菌 30 分鐘。）四、實驗步驟選用的子實體先經(jīng) 0.1%開汞水或 70%酒精表面消毒后。用無菌水沖洗并用無菌紗布擦

13、去表面水分。如分離香菇時用無菌解剖刀自菌柄處切開少許，再用手將子實體掰開為二，在菌蓋與菌褶交界處，切取 0.30.4 立方厘米的一小塊菌肉，移放在斜面培養(yǎng)基中央。如已開傘的種菇、則選菌蓋與菌柄交界處的菌肉。分離草菇時，用無菌解剖刀把菌蕾縱切少許；再用手把菌蓋輕輕剝開，在菌柄上方和菌蓋交界處，切取 15 毫米的細塊，接在斜面培養(yǎng)基中。如種菇已受雨淋，吸水較多，應取菌褶作為接種材料。組織分離后將試管外面放在恒溫箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍萌發(fā)出菌絲，并向培養(yǎng)基蔓延生長后，再挑取生長健壯的菌絲進行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。組織分離法操作簡便，又不易帶入雜菌，容易獲得純菌種。但對銀耳、黑木耳等膠質(zhì)菌，因其子實體中菌絲的含量

14、極少，如用組織分離培養(yǎng)，則往往不易成功。五、實驗結(jié)果根據(jù)觀察結(jié)果比較兩菌種間菌絲生長情況和同一菌種不同部位組織分離后菌絲生長情況，評價何種部位更適宜該菌種的組織分離繁殖，并對操作的各個環(huán)節(jié)提出改進建議。六、注意事項(1)此法對于膠質(zhì)的耳類及菇體較小較薄的菇類，如金針菇等不太適宜。(2)此法應嚴格遵循無菌操作。(3)子實體在升汞溶液中消毒時間應嚴格按規(guī)定時間進行，漂洗要迅速，否則子實體受損太大，影響效果。七、思考題如何避免因污染而造成的組織分離的失?。繉嶒炄?、菌種的液體石蠟保藏一、目的學習掌握液體石蠟法保藏菌種的原理和方法。二、原理微生物個體微小、代謝活躍、生長繁殖快，如果保存不妥容易發(fā)生變異，

15、被其他雜菌污染，甚至導致細胞死亡，這種現(xiàn)象屢見不鮮。菌種的長期保藏對任何微生物學工作者都是很重要的，也是非常必要的。自從19世紀末F.Kral開始嘗試微生物菌種保藏以來已建立了許多長期保藏菌種的方法。雖不同的保藏方法其原理各異，但基本原則是使微生物的新陳代謝處于最低或幾乎停止的狀態(tài)。保藏方法通?；跍囟?、水分、通氣、營養(yǎng)成分和滲透壓等方面考慮。液體石蠟法保藏菌種方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟， 達到菌體與空氣隔絕、使菌處于生長和代謝停止狀態(tài)，同時石蠟油還防止水分蒸發(fā)、在低溫下達到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-44c 下。此法實用且效果較好，產(chǎn)抱子的霉菌、放線菌、芽抱菌可保藏 2 年以上，有些酵母菌可保 12 年，一般無芽抱細菌也可保藏 1 年左右。方便但必須直立存放。三、實驗步驟1、液體石蠟滅菌：在 250mL 三角燒瓶中裝入 100mL 液體石蠟，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，12lC 濕熱滅菌 30min,然后于 40c 溫箱中放置 14d（或置于 105110c 烘多!中 1h）,以除去石蠟中的水分，備用。2 .接種培養(yǎng)：同斜面?zhèn)鞔２胤ā?