實驗九-葉綠素的提取、分離

1、葉綠素的提取、分離一 、實驗目的 1. 掌握從植物葉中提取葉綠素的方法。2. 了解紙層層析的原理，掌握紙層析的一般操作和定性鑒定方法。二、實驗原理1. 葉綠素提取原理：葉綠素等是脂溶性的有機分子，根據(jù)相似相溶的原理，葉綠體中含有葉綠體色素（葉綠素a和b、胡蘿卜素及葉黃素）等色素分子溶于有機溶劑而不溶于有極性的水。故在研磨和收集葉綠色素時要用丙酮或乙醇等有機溶劑提取而不用水。 2. 色素分離的原理：紙層析是用濾紙作為載體的一種色層分析法，其原理主要是利用混合物中各組分在；流動相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分離。濾紙上吸附的水為固定相（濾紙纖維常能吸20%左右的水），有機溶劑如乙醇等為流

2、動相，色素提取液為層析試樣。把試樣點在濾紙的濾液細線位置上，當流動相溶劑在濾紙的毛細管的作用下，連續(xù)不斷地沿著濾紙前進通過濾液細線時，試樣中各組份便隨著流動相溶劑向前移動，并在流動相和固定相溶劑之間連續(xù)一次有一次的分配。結(jié)果分配比比較大的物質(zhì)移動速度較快，移動距離較遠；分配比較小的物質(zhì)移動較慢，移動距離較近，試樣中各組分分別聚集在濾紙的不同的位置上，從而達到分離的目的。剪紙形狀濾液基線 毛細管點樣 薄層色譜展開三 、儀器和藥品研缽、毛細管、漏斗、紗布、小燒杯、試管、培養(yǎng)皿等95%酒精、丙酮、石油醚碳酸鈣，石英砂四、實驗步驟（1） 取菠菜或其他植物新鮮葉片20g左右，洗凈，用濾紙擦干，去掉葉柄和

3、中脈剪碎，放入研缽。（2） 研缽中加入少量碳酸鈣和石英砂，加4-5ml 75乙醇，研磨至糊狀，再加10-15ml 75乙醇充分混勻以提取葉片勻漿中的色素，15-20分鐘后，過濾入50ml錐形瓶中加塞待用。分離：（1） 取圓形定性濾紙一張（直徑15cm），將其剪成濾紙條（15cm×2cm），將其2cm一端剪去兩側(cè)，中間留一長約1.5cm，寬約0.5cm的窄條，并在濾紙剪口上方用鉛筆畫一條直線，作為畫濾液細線的基準線（注意：濾液線必須距底邊1-1.5cm）。 用毛細管吸取乙醇葉綠體色素提取液，沿紙條的濾液線涂，等風干后，再重復操作數(shù)2-3次。 （用濾液涂圓點狀類似）（2）在層析缸中加入適

4、量（約2ml）的丙酮作為推動劑，將濾紙條帶有色素的一端輕輕插入層析缸中，使濾紙條下端浸入推動劑中。迅速蓋好層析缸蓋，靜置40-60min。此時，推動劑借毛細管引力順濾紙條向上擴散，并把葉綠體色素向上推動，不久即可看到各種色素的條帶。 （3）當推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風干，即可看到分離的各種色素，從上到下為：胡蘿卜素為橙黃色、葉黃素為鮮黃色、葉綠素a為藍綠色，葉綠素b為黃綠色，用鉛筆標出各種色素的位置和名稱。五、數(shù)據(jù)記錄六、注意事項：1. 紙層析法中所用的有機溶劑如丙酮、石油醚等，一般有揮發(fā)性、并有一定毒性，使用時要注意密封層析，避免吸入過多有害揮發(fā)物。2. 葉綠素分布于基粒的片層薄膜上，加入少許二氧化硅是為了磨碎細胞壁、質(zhì)膜、葉綠體被膜和光合片成，使色素溶解于酒精中。 3. 插入層析液的濾紙條一端剪去兩個角，由于液面的不同位置表面張力不同，紙條接近液面時，其邊緣的表面的張力較大，層析液沿濾紙邊緣擴散過快，而導致色素帶分離不整齊的現(xiàn)象。4. 加入的層析液要適量，濾紙放入層析缸時色素濾液線不能接入層析液，為了防止濾紙條倒入層析液中而使層析實驗失敗。同時，防止因液體表面張力引起層析液沿濾紙條向上的“壁流”而導致色素溶解。 七、思考題：1. 在研磨時為